A glükóz meghatározása glükóz-oxidáz módszerrel

Elemzések

A vérben a glükóz koncentrációjának meghatározása a laboratóriumok egyik leggyakrabban elvégzett biokémiai vizsgálata.

A vérben és a vizeletben a glükóz meghatározására szolgáló glükóz-oxidáz-módszer a glükóz-oxidáció reakcióján alapul a glükóz-oxidáz enzim jelenlétében hidrogén-peroxid képződésével, amely peroxidáz jelenlétében oxidál orthotolidint, hogy színes termékeket képezzen; o A glükóz koncentrációját a színes termékek mennyisége ígéri.

Mivel a glükóz-oxidáz módszer a glükóz és nem minden cukortípus meghatározására irányul, ezt a következő betegségek differenciáldiagnosztikájában használják:

A glükóz-oxidáz-módszer elve a glükóz meghatározására

A glükózt a glükóz-oxidáz enzim jelenlétében atmoszferikus oxigénnel oxidálják, hogy hidrogén-peroxidot képezzenek a reakció során. A peroxidáz enzim jelenlétében a hidrogén-peroxid oxidálja az orthotoluidint, hogy színes vegyületet képezzen, amelynek színintenzitása arányos a glükóz tartalommal. Ez a módszer lehetővé teszi a vérplazma, a szérum és a cerebrospinális folyadék glükózszintjének meghatározását.

Normál vércukorszint, mmol / l

- plazmában, natsheartse-ben

újszülöttek - 1,7 - 4,2
6 hetes és 15 éves kor közötti gyermekek - 3,3 - 5,4
felnőttek (férfiak, nők) - 3,9 - 5,6

- szérumban, natsheartse-ben

újszülöttek - 2.6 - 4.2
6 hetes és 2 éves kor közötti gyermekek - 3.3 - 5.4
felnőttek (férfiak, nők) - 3,9 - 5,6

A glükóz-meghatározáshoz szükséges reagensek a glükóz-oxidáz módszerrel

1. Nátrium-klorid 9 gramm / liter (izotóniás oldat): 0,9 g nátrium-klorid 100 ml vízben való feloldásával készült.

2. 50 g / l cink-szulfát: 5 g cink-szulfátot (ZnSO4) feloldunk vízben, a térfogatot 100 ml-re állítjuk be.

3. 0,3 mol / l nátrium-hidroxid: 1,2 g nátrium-hidroxid 100 ml vízben való feloldásával állítjuk elő, a koncentrációt titrálással ellenőrizzük (0,3 n).

4. Orthotolidin, 1% -os oldat: 1 g hatóanyagot feloldunk 100 ml abszolút alkoholban. Az oldatot hűtőszekrényben, üvegdugóval ellátott lombikban több hónapig tárolhatjuk. A kereskedelmi forgalomban kapható terméket átkristályosítással tisztíthatjuk, amelyhez abszolút alkoholt feloldunk, vizet adunk hozzá, és a kicsapódott kristályokat leszűrjük egy szűrőn, majd kalcium-kloridon szárítjuk.

5. Acetát-pufferoldat, pH 4,8: 4 rész 0,25 n ecetsavat (titrálással ellenőrizve) és 6 rész 0,25 n nátrium-acetátot tartalmaz (34 g CH3COONa X ЗН2О 1 literben).

6. A glükóz-oxidáz száraz készítmény 3000 egység / mg vagy annál nagyobb aktivitással.

7. Torma peroxidáz. Az 1 mg-ot 5 ml acetát pufferben oldjuk, több napig hűtőszekrényben tárolható.

8. Munkaoldat: 2 mg glükóz-oxidázt és 1 mg peroxidázt 80 ml acetátpufferben oldunk, adjunk hozzá 1 ml 1% -os ortotolidin oldatot, keverjük össze és a térfogatot pufferoldattal 100 ml-re hígítjuk. A reagensnek átlátszónak, színtelennek vagy halvány zöld árnyalatúnak kell lennie, amely esetben hidegben tárolva stabil. Ha a szín intenzív, vagy néhány órával az elkészítés után egy csapadék kezd csökkenni, ez azt jelenti, hogy az orthotolidin nem elég tiszta, és át kell kristályosítani.

9. Kalibrációs glükózoldatok. A glükózt 37 ° C-on előszárítjuk és exszikkátorban tároljuk. Először készítsünk 50 mmol / l koncentrációjú bázikus oldatot, amelyhez 180 mg anyagot feloldunk 20 ml telített oldatban (kb. 0,3%) benzoesavban. Ebből az oldatból készítsünk 3-at tartalmazó munka kalibrációs oldatokat; 6; 9; 12; 15; 18 és 21 mmol / l, amelyre 0,6; 1,2; 1,8; 2.4; 3; 3,6 és 4,2 ml bázikus oldatot, és a telített benzoesav-oldatot 10 ml térfogatra állítjuk. Ezek az oldatok glükózt tartalmaznak ugyanolyan koncentrációban, mint a vérben, ami megkönnyíti a számításokat a kalibrálás során.

A glükóz meghatározása a glükóz-oxidáz módszerrel

A centrifugacsőben 1,1 ml nátrium-klorid-oldatot, 0,4 ml cink-szulfát-oldatot és 0,4 ml 0,3 n nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá; ugyanakkor egy nagyon vékony cink-hidroxid-gél képződik, 0,1 ml vér vagy kalibráló oldat szabadul fel, újra összekeverjük és 10 percig centrifugáljuk 3000 fordulat / perc sebességgel 10 percig.

1 ml felülúszóhoz adjunk hozzá 3 ml munkaoldatot és óvatosan keverjük össze.

A szín fokozatosan kezd kialakulni, ami normál szobahőmérsékleten 13-15 perc alatt eléri a maximumot, majd fokozatosan csökken. Fotometrikusan mindig ugyanezen idő után, miután hozzáadta a munkareagens küvettákhoz 1 cm-es optikai úthosszúságú vörös fényszűrővel (hullámhossz 625 nm) az üresjárati élmény ellen, amelyet egyidejűleg a munka mintákkal állítanak be, de a vér helyett fiziológiás nátrium-klorid-oldatot alkalmazunk.

A kalibrációs gráf elkészítésekor a megfelelő kalibrációs oldat 0,1 ml-ét veszik a vérminták helyett.

A glükóz kiszámítása az arányok szabálya vagy a kalibrációs ütemezés szerint történhet, hogy a glükóz koncentrációja (mmol / l) egy tengelyre kerüljön, és a kihalási érték a másik.

Megjegyzések a glükóz-meghatározás módszerére glükóz-oxidáz módszerrel

1. Először szabaddá válhat a vér a pipettáról egy nátrium-klorid izotóniás oldatába, majd adjunk hozzá cink-szulfát és nátrium-hidroxid-oldatot.

2. Szisztematikus munka esetén nincs szükség állandó pontosságú kalibrációs ütemtervre minden pontra, elegendő egy üres mintát és 2-3 pontot 3-9 mmol / l naponta feldolgozni, és csak egy teljes kalibrációs ütemtervet készíteni a reagensek cseréje vagy az eljárás módosítása során.

Glükóz-oxidáz módszer a glükóz meghatározására

A glükóz-oxidáz-módszert kizárólag a különböző testfolyadékokban a glükóz koncentrációjának meghatározására használják. Ennek a tesztnek az előnye a pontosság. A diagnosztika a gyors módszerekkel ellentétben lehetővé teszi a tiszta glükóz mennyiségének feltárását fruktóz és más cukrok nélkül. Ennek a reakciónak az elve az, hogy az oldatot az oxidálószerek specifikus festékekkel való kölcsönhatása következtében színezzük. A kutatási eredmények értékelését a kolorimetria módszerével és a standard oldatokkal való összehasonlítással végezzük.

Mikor írják elő a glükóz-oxidáz-módszert?

Ezt a vizsgálatot arra használják, hogy kimutassák a cukor toleranciáját és a cukorbetegség előrehaladását, valamint a betegség magasságát. Az elemzést azonban ritkán használják fel az ilyen célokra, ez a magas költsége és az eredmény hosszú várakozása miatt következik be. Leggyakrabban a vérben és a vizeletben a glükóz meghatározását ezen módszer alkalmazásával a betegségek differenciáldiagnosztikájában alkalmazzák, mint például:

laktóz intolerancia szindróma;
fruktóz intolerancia;
a fruktóz felszabadulása testfolyadékokkal;
fokozott pentóz koncentrációja a vizeletben.

A glükóz-oxidáz teszt kétségtelen előnye a pontosság.

Mi az alapja ennek a módszernek?

A glükóz koncentrációjának meghatározására különböző módszerek vannak, de a glükóz-oxidáz a legpontosabb. A lényeg az, hogy a cukor és a levegő oxigénnel való kölcsönhatása oxidálja a reagenst. A hidrogén-peroxid oldódik az oldatba. Ez az anyag kölcsönhatásba lép az orthotoluidinnel, színezett vegyületet képezve. E reakció viselkedéséhez speciális enzimek jelenléte szükséges. A glükóz oxidáznak jelen kell lennie az oxidációs reakcióban, és a peroxidáz a folyadék festésében. Az oldat színének intenzitása a glükóz tartalmától függ, és a legmagasabb mennyisége a legmagasabb.

A glükóz-oxidáz-módszer lényege a glükóz meghatározására

Az eredmény értékelése a fotometria kvantitatív módszerével azonos időintervallumban történik. Győződjön meg róla, hogy olyan kalibrálási oldatot használ, amely egy bizonyos cukorszintet tartalmaz, és kezdve attól kezdve megítélheti a glükóz koncentrációját a testfolyadékokban, gyakran a vérben.

Hogyan történik az elemzés?

Az anyagot a betegből egy üres gyomorban veszik. Vénás vért használó vizsgálathoz 5 ml mennyiségben. A diagnózis előestéjén a beteg szigorú étrendet mutat. Ez lehetővé teszi az eredmény megbízhatóságának megítélését és az esetleges elemzési hibák kizárását. 2 nappal a vér visszavonása előtt a páciensnek lemondania kell az ivás és a dohányzás rossz szokásairól. Szükséges továbbá a túl édes ételek bevitelének korlátozása és, ha lehetséges, a stresszes helyzetek elkerülése.

A glükóz koncentrációjának meghatározására szolgáló eljárást leggyakrabban a centrifugálás módszerével végzik, amelyet a formázott elemek elválasztására használnak. A cukor mennyiségét a plazmában határozzuk meg. Ha az összes szükséges reagens hozzáadásra kerül, a szín 20 perc elteltével figyelhető meg, ha a vizsgálatot szobahőmérsékleten végezzük. A glükózszint kiszámítása a kalibrációs ütemterv szerint történik, vagy az adagok szabálya szerint.

Reagensek a kutatáshoz

A cukor meghatározása a legmegfelelőbb a vér glükóz meghatározására szolgáló gyors módszerek alkalmazása. Ennek oka az egyszerű használat és a gyors eredmények. Emellett a betegnek nem kell a laboratóriumba vagy a kórházba mennie. De a glükóz-oxidáz teszttől eltérően egy ilyen diagnózis megbízhatatlan. Mivel nem különbözteti meg a glükózt más cukroktól, és meghatározza azok koncentrációját.

A glükóz-oxidáz reakció alapja a 9% -os nátrium-klorid-oldat és a cink-szulfát 50%. Ezeket hozzáadjuk a vér centrifugálásának szakaszában. Ezenkívül ecetsavval és nátrium-acetáttal pufferoldatot használunk. A titrálási módszer a pH értékét 4,8-ra határozza meg. Ezután hozzáadunk glükóz-oxidázt, amely hidrogén-peroxidot és peroxidázt eredményez, amely részt vesz az oldat kívánt koncentrációjához, hogy pontos eredményt kapjunk.

Szabványok az elemzés során

A cukor mennyiségét speciális egységekben - millimól / liter oldatban mérjük.

A glükóz-oxidáz vérvizsgálatokat üres gyomorban kell végezni, és ehhez plazmát vagy szérumot kell alkalmazni. A nők és férfiak felnőttkori számának aránya 3,3-5,5. A 15 év alatti gyermekek számára ez a szám valamivel alacsonyabb, és 3,2 és 5,3 között változik. Újszülötteknél a vércukorszint 1,7–4,2. A teljesítmény növekedését a cukorbetegségben szenvedő beteg vagy a glükóz tolerancia megsértésével figyelték meg. Ez az állapot prediabetes, és ha nem kezelik időben, akkor hamarosan ez a súlyos patológia kialakulásához vezet.

MŰKÖDÉSI SZÁM 1. A GLUKÓZIS MÉRETÉNEK MEGHATÁROZÁSA A vérben. ENZIMATIKUS (GLUCOSOOXIDÁLIS) MÓDSZER

A MŰKÖDÉS TELJESÍTÉSÉNEK ALAPELVEI. A glükóz meghatározását a teljes vérben vagy a plazmában minden betegben elvégezzük a szénhidrát anyagcsere állapotának és a patológia diagnosztizálásának (hiperglikémia, hipoglikémia) megállapításához. A glükóz oxigén jelenlétében történő glükóz oxidációján alapuló enzimatikus módszert alkalmazzák a vércukor-tartalom meghatározására. A módszer nagyon specifikus a D-glükóz meghatározására más redukálószerek jelenlétében, amelyek a szövetkivonatokban és a biológiai folyadékokban vannak jelen.

A MÓDSZER ELVE. A glükóz-oxidáz egy komplex enzim, amely protéziscsoportként FAD-t tartalmaz. Ha a glükóz oxidálódik glükóz-oxidázzal, két glükózatom szétválik a glükózmolekula első szénatomjából. Ezenkívül ezek a két hidrogénatom átadódik a FAD-nak, az FADH képződik₂. Ez utóbbi a hidrogénatomokat molekuláris oxigénre szállítja a H formába₂Oh₂. Ezután H₂Oh₂ a peroxidáz enzimmel vízre és atomi oxigénre hasítja, amely oxidálja a kromogént (színezéket), amely az oxidáció során színeződik.

Glükóz oxidáz módszer

Napjainkban a glükóz-oxidáz enzim használatán alapuló módszereket a legszélesebb körben használják. A módszer a következő reakción alapul:

A glükóz-oxidáz katalizálja a glükóz első szénatomjától származó két hidrogénatomot egy folyékony reagensben oldott oxigénre. A reakció során a hidrogén-peroxid ekvimoláris mennyiségben képződik. Ie a képződött hidrogén-peroxid koncentrációja pontosan megegyezik a meghatározott glükózkoncentrációval. Következésképpen a glükóz-oxidáz-reakció alkalmazása a glükózkoncentráció meghatározásának problémáját a hidrogén-peroxid-koncentráció meghatározásának problémájává alakította át, amely, amint az alábbiakban látható, sokkal egyszerűbb, mint az első. És itt számos olyan módszer létezik, amelyeket a laboratóriumi gyakorlatban széles körben használnak (lásd az ábrát).

A fenti regisztrálási módszerek közül a legszélesebb körben használt fotometriai biokémiai módszer, amelyben a peroxidáz enzim hatására hidrogén-peroxid molekulák az aktív oxigénforma - szuperoxid anion-radikális - képződésére oszlanak.₂ -, amely viszont a kromogént oxidálja, ami a kromogén abszorpciós spektrumának jelentős változásához vezet.

Ennek a módszernek a nagyfokú népszerűsége a glükóz meghatározásában nagyfokú sajátossága és egyszerű megvalósítása miatt van. A módszer hagyományos fotométerrel, valamint automatikus biokémiai autoanalizátorokkal is megvalósítható.

A glükóz-oxidáz-módszert ma a glükóz meghatározásának egyik legpontosabb kvantitatív módszerének ismerik el. Biológiai anyagként szérumként és teljes vérként alkalmazzák. Az utóbbival való munkavégzés során figyelembe kell venni azt a tényt, hogy a kapilláris vér bevételekor a szérum (plazma) aránya függ a hematokrit értékétől, ami hátrányosan befolyásolhatja az eredmény pontosságát. Ezért a glükózt a fent leírt módszerrel meghatározva előnyös a beteg szérumát használni.

A végpont fotometriai módszerrel pár évvel ezelőtt megjelentek a készletek, amelyekben a kinetikus fotometriai módszert alkalmazták. A módszer lényege, hogy a glükóz-oxidáz és a peroxidáz aktivitásának bizonyos arányában a színes vegyület képződésének sebessége egy ideig a minta munkaoldathoz való hozzáadása után arányos a minta glükózkoncentrációjával. Ennek az eljárásnak az az előnye, hogy az eredmény nem függ más minták jelenlététől a mintában, mivel az utóbbi abszorpciója idővel stabil. Ez a módszer kinetikus fotométer, félautomata elemzők vagy automatikus biokémiai analizátorok használatát igényli. A teljes vérből származó glükózkoncentráció mérését kényelmesen olyan műszerek alkalmazásával végezzük, amelyek működését az amperometriás mérési elv alapján végezzük, speciális enzimérzékelőket használva. A hidrogén-peroxid rendkívül instabil kémiai vegyület, és töltött részecskék forrásaként szolgálhat. Ezt használják a membrán típusú enzimérzékelőkben vagy a hordozható glükométerek elektrokémiai elemeiben.

Összefoglalva, meg kell említenünk a glükóz-oxidáz módszer hátrányait. A kapott hidrogén-peroxid- és szuperoxid-anioncsoport nemcsak a kromogént, hanem a biológiai folyadékban jelen lévő egyéb anyagokat is oxidálhatja: aszkorbinsavat, húgysavat, bilirubint. Ezzel egyidejűleg csökken a kromogén oxidációjában részt vevő peroxid aránya, ami a glükóz eredmény alulbecsléséhez vezet. Ez a módszer általában lineáris, akár 20-30 mmol / l glükóz.

A vércukorszint kvantitatív meghatározása glükóz-oxidáz módszerrel

A módszer elve. Az eljárás a glükóz oxidáz enzim hatásának specifitására épül. Ez az enzim a glükózt molekuláris oxigén jelenlétében oxidálja glükonolaktont képezve, amely spontán glükonsavvá hidrolizál. A glükóz oxidáz oxidálja a glükózt hidrogén-peroxiddá (H)₂Oh₂), amely peroxidáz hatására 4-aminoantipirinnel és fenollal reagál. Az eredmény egy rózsaszín színű vegyület, amelynek optikai sűrűsége 510 nm-en arányos a mintában lévő glükóz koncentrációjával.

2 N₂Oh₂ + 4-aminoantipirin + fenol → kinon-imin + 4H₂Oh

berendezés: KFK, centrifuga, termosztát, állványok, kémcsövek, pipetták, biológiai anyagok, a munkaoldatban lévő reagensek.

vizsgálati minta, ml

standard minta, ml

egyetlen vizsgálat (N₂O), ml

Kalibrációs glükóz oldat (standard)

A csöveket 15 percig 37 ° C-os termosztátban inkubáljuk, majd zöld szűrővel ellátott zöld szűrővel színezzük ki 5 mm-es rétegvastagságú küvettákban egy üres (H₂O). A rózsaszín szín az inkubálás után 1 órán át stabil.

számítás a következő képlet által előállított glükóz-tartalom:

C = x C szabvány, ahol

C a kísérleti minta glükóz-tartalma, mol / l;

Az Eop a minta optikai sűrűsége;

Az Est a kalibrációs minta optikai sűrűsége;

С standard - kalibrációs oldat, mol / l tartalom.

Normál értékek:  újszülöttek - 2,8-4,4 mmol / l

 gyermekek - 3,9 -5,8 mmol / l

 felnőttek - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hipoglikémia (HGH). A vércukorszint növekedése számos okból következik, amely szerint a hiperglikémia két csoportja van.

1. Szigetelt - az inzulin szervezetben nem elegendő mennyiségű vagy hatásának hiánya miatt.

2. Extrainsular (extrainsular) - nem függ az inzulin hatásától.

A következő folyamatok a HGH kialakulásában a legjelentősebbek: fokozott glikogén lebontás; megnövekedett neoglükogenezis; glikogén szintézis gátlása; a glükóz kihasználtság csökkenése az inzulin hormonális antagonistái (szomatotropin, glükortikoidok, tiroxin, tirotropin) hatására.

A vérben túlzott mennyiségű glükózszintet figyeltek meg az élesztő hyperglykaemia (például a hiperglikémia cukorterhelés alatt). "Máj" hiperglikémia a máj diffúz elváltozásaiban jelentkezik.

A tartós és súlyos hiperglikémia leggyakrabban cukorbetegséggel jár. Az inzulinfüggő diabetes mellitus és az inzulin-függő diabetes mellitus, illetve az I. típusú diabetes mellitus és a II. Az I. típusú diabetes mellitus kialakulása elsősorban az inzulin szintézisének és cseréjének csökkenésével jár.

A hiperglikémia második csoportja elsősorban az hormonális hormonokat termelő inzulin antagonisták hiperfunkciójának köszönhető. Olyan betegségekben figyelhető meg, mint a szindróma és a Cushing-kór, az akromegalia, a tirotoxikózis, a feokromocitoma, a glükogenoma. A vércukorszint is emelkedik bizonyos májbetegségekben (különösen a máj cirrhosisában szenvedő betegek 10-30% -ában), hemochromatosis (a máj pigmentált cirrhosisában, bronz diabetesben).

Hipoglikémia (HGP) - vércukorszint csökkenése - leggyakrabban az inzulinszint abszolút vagy relatív növekedésével jár. Vnepankreaticheskim hipoglikémia megfigyelt eredményeként közötti egyensúly hiányának mértékét a folyamatok a glikogenolízis és glükoneogenezis a májban az akut és krónikus hepatitis, cirrhosis, akut és szubakut májbetegség, alkoholos intoxikáció, mérgezés arzén, foszfor, során a meghosszabbított mechanikai sárgaság, pangásos máj, primer vagy metasztatikus májrákot. A nyelőcsőrákban és más extrapancreatikus lokalizációban (pl. Fibroma, fibrosarcoma, neuroma) szenvedő betegeknél gyakran megfigyelhető a vércukor koncentráció csökkenése, valamint a hányás, az anorexia, a máj diabetes, az urémia, a bőséges laktáció és a glükozuria.

A hipoglikémia központi eredetű lehet a mentális trauma, az encephalitis, a subarachnoid vérzés, agydaganat következtében.

1. A szénhidrát emésztés örökletes rendellenességei.

2. Milyen típusú hiperglükóz van az Ön számára?

3. Melyek a kóros hiperglükozémia okai?

4. Mi az oka az inzulinfüggő diabetes mellitusnak?

5. Melyek az örökletes betegségek biokémiai okai: a) glikogenózis? b) aglikogenózis? c) fruktoszémia? d) galaktoszémia?

6. Milyen biokémiai változások következnek be a szénhidrát anyagcsere során éhgyomorra?

7. A glükóz tolerancia meghatározásának módszere.

Glükóz-oxidáz és hexokináz módszerek a vérben a szérum glükóz meghatározására

A pontos diagnózis, a kezelés előírása számos laboratóriumi vizsgálatot igényel.

A szérum glükóz meghatározásának módszere a legfontosabb eszköz a hiper- és hypoglykaemia kimutatására diabetes mellitusban szenvedő betegeknél.

A módszer lehetővé teszi az orvosi terápiás adatok metabolikus rendellenességeinek beállítását. Diagnosztikai glükózszintek is meghatározhatók teljes vérben és plazmájában.

A vércukorszint meghatározásának módszerei

A vérben lévő glükóz mennyiségének meghatározására szolgáló módszerek sokat fejlődtek.

Némelyikük (redukciós, kolorimetriás) gyakorlatilag nem a nagy toxicitás és az eredmények alacsony pontossága miatt használatos.

A leggyakrabban használt enzimvizsgálatok. A glükóz-oxidáz módszer a színreakció módszere, amely akkor fordul elő, ha a szénhidrátokat melegítik. A hexokináz meghatározza a vér hexokináz aktivitását.

Glükóz oxidáz módszer

A vércukorszint meghatározására szolgáló glükóz-oxidáz-módszer az enzim hatására bekövetkező oxidációs reakción alapul. Ez hidrogén-peroxidot képez, foltja a kromogén anyagot, amelynek koncentrációja meghatározza a glükóz mennyiségét.

A glükóz-oxidáz-módszert használják:

örökletes fruktóz intolerancia;
pentosuria;
laktulóz intolerancia.

A vizsgálat hátránya, hogy a hidrogén-peroxid képes a vérben lévő kromogén és az aszkorbinsav, a húgysav és a bilirubin oxidálására. Számítsuk ki a glükóz fotometriai módszer mennyiségét, a festés intenzitását összehasonlítjuk a kalibrációs gráfmal.

Laboratóriumi körülmények között meghatározható az anyag szintje:

vénás vérben. Automatikus analizátorokat használnak;
kapilláris vérben. A kerítés ujjától történik.

Az elektrokémiai módszer glükóz-oxidázt tartalmazó elektródok alkalmazásával áll. Meghatároztuk a keletkezett hidrogén-peroxid mennyiségét vagy az oxidációs folyamat során felhasznált oxigén maradék szintjét.

Hexokináz módszer

Az anyag a glükóz metabolizmus legfontosabb enzimje, amely korlátozza a sejtek folyamatának sebességét.

Laboratóriumi körülmények között a hexokináz hatására a glükóz foszforilálódik adenozin-trifoszfáttal.

A reakció eredményeként szerves molekulák képződnek, amelyek mennyiségét az ultraibolya zónában a fényelnyelés mértéke határozza meg. Túl gyors pozitív hexokináz reakció is lehet a rosszindulatú daganatok előfordulásának jele.

Előkészítés az elemzéshez

A vérszérum glükóz teszteket a következőkre írják elő:

Az elemzés előtt számos feltételnek kell megfelelnie, hogy az eredmények a lehető legmegbízhatóbbak legyenek:

kutatást üres gyomorban végeznek. Reggel vett anyag;
néhány nappal a diagnózis előtt szükséges elkerülni a nehéz fizikai terhelést, a stresszt;
A napi étrendben a betegnek legalább 150 gramm szénhidrátot kell tartalmaznia. Hiányosság esetén a glükóz szintje növekedni fog, és lassan csökken, ami torzítja az adatelemzést;
a diagnózis előtti napon nem lehet dohányozni és alkoholtartalmú italokat inni;
a nehéz műtétek, szülés, gyulladás jelenlétében végzett kutatás nem lehetséges. Ellenjavallt a májcirrhosis, a gyomorbetegségek súlyosbodása, tumor folyamatok elemzése során;
pár nappal a vizsgálat előtt nem szabad fizioterápiás eljárásokat elvégezni, szájon át fogható fogamzásgátlók, diuretikumok, pszichotróp gyógyszerek, koffein.

Az elemzés hamis pozitív eredményt adhat a hypokalemia és az endokrin betegségek (Cushing-szindróma, tirotoxikózis) esetén.

A vérszérum glükóz normái életkor szerint

A normál mutatók életkortól függenek:

a vérzsinórvér 2,5-5,3 mmol / l;
koraszülötteknél - 1,1-3 mmol / l;
az élet első napjának gyermekei - 2,22 és 3,33 között;
2,7 és 4,4 év közötti korban;
6 évesnél idősebb gyermekeknél - 3,3-5,5 mmol / l;
felnőtteknél legfeljebb 60 évig - 4,4 és 6,3 között;
idősekben - 4,6 és 6,1 mmol / l között.

A felnőtteknél a hipoglikémiát 3,3 mmol / l-nél alacsonyabb glükóz értékkel diagnosztizálják, a hiperglikémiát pedig több mint 6,1 mmol / l.

Glükóz-oxidáz módszer a glükóz plazmában történő meghatározására

Örömmel üdvözöljük Önt a www.unimedao.ru oldalon!

Köszönjük, hogy válaszolt a kérdésre.

19.11.2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

A News A / O Unimed újságának archívumából

A vérben a glükózkoncentráció meghatározása a QDL egyik leggyakrabban elvégzett biokémiai vizsgálata. A vizsgálat kivételes népszerűségének oka a diabétesz magas előfordulási gyakoriságával jár. Ezt a vizsgálatot mind a kórházi, mind a járóbeteg-klinikákban végzik. A cukorbetegek kénytelenek megvizsgálni a vérben lévő glükóz szintjét otthon, mivel ezen információk nélkül nehéz nekik beállítani a diétát, a testmozgást, az inzulin és más antidiabetikus szerek alkalmazását. A vizsgálat kivételes jelentősége és a nagy kutatási mennyiségek ösztönzik a fejlesztőket, hogy különböző típusú eszközöket és módszereket hozzanak létre a vérben a glükóz koncentrációjának meghatározására.

Jelenleg számos módszer létezik a glükóz meghatározására. Ezek az alábbiak szerint osztályozhatók.

A szérum glükóz meghatározásának módszerei

- végpont fotometrikus

- fényvisszaverő fotometria - száraz kémia

Az első két módszer rendkívül kényelmetlen, mérgező és alacsony pontossággal rendelkezik, így nem fogunk rájuk élni.

Glükóz oxidáz módszer

Napjainkban a glükóz-oxidáz enzim használatán alapuló módszereket a legszélesebb körben használják. A módszer a következő reakción alapul:

Az 1. ábrán Az 1. és 2. ábra a standard oldat glükózoldat hozzáadása előtt és után mutatja a munkaoldat spektrumát. A reakcióelegy - (reagens + glükóz) maximális felszívódása 500 nm tartományban van. Ennek megfelelően a végső reakció optikai sűrűségének változása 480-520 nm hullámhosszon arányos a mintában lévő glükózkoncentrációval.

Ennek a módszernek a nagyfokú népszerűsége a glükóz meghatározásában nagyfokú sajátossága és egyszerű megvalósítása miatt van. Az eljárást hagyományos fotométerrel lehet megvalósítani (jobb, mint egy speciális biokémiai fotométer, mint például a Mikrolab 540), vagy automatikus biokémiai autoanalizátorok segítségével.

A végpont fotometriai módszerrel pár évvel ezelőtt megjelentek a készletek, amelyekben a kinetikus fotometriai módszert alkalmazták. A módszer lényege, hogy a glükóz-oxidáz és a peroxidáz aktivitásának bizonyos arányában a színes vegyület képződésének sebessége egy ideig a minta munkaoldathoz való hozzáadása után arányos a minta glükózkoncentrációjával. Ennek az eljárásnak az az előnye, hogy az eredmény nem függ más minták jelenlététől a mintában, mivel az utóbbi abszorpciója idővel stabil. Ez a módszer kinetikus fotométer használatát igényli, mint például a Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, félautomata elemzők, mint például a Clima 15, vagy automatikus biokémiai elemzők. A teljes vérből származó glükózkoncentráció mérését kényelmesen olyan műszerek alkalmazásával végezzük, amelyek működését az amperometriás mérési elv alapján végezzük, speciális enzimérzékelőket használva. A hidrogén-peroxid rendkívül instabil kémiai vegyület, és töltött részecskék forrásaként szolgálhat. Ezt használják a membrán típusú enzimérzékelőkben vagy a hordozható glükométerek elektrokémiai elemeiben.

A teljes vérből (rendszerint 20 μl) mintát pufferoldattal hígítunk (vörösvérsejtek elpusztulnak), majd egy vonalon keresztül egy áramlási cellába táplálnak. A glükóz oxidálódik a membránon található glükóz-oxidáz enzim hatására. A kapott hidrogén-peroxid a membránon keresztül diffundál, és a katalitikus reakcióban platina hatására tovább oxidálódik. A hidrogén-peroxid diffúziója a platina felületén a H molekulák számával arányos áramot képez₂Oh₂. Az így kapott jelet a készülék a megfelelő feszültségértékkel dolgozza fel. Ez a mért érték arányos a mintában lévő glükóz koncentrációjával.

Például a fentiekben leírt módszerrel megemlíthetjük a Biosen glükózanalizátorokat (Németország). Ezek az eszközök nemcsak kórházakban, hanem poliklinikában is használhatók, ahol a glükóz tesztelés főként kapilláris vérből történik.

A klinikai laboratóriumi diagnosztikai módszerek kidolgozásának fontos lépése a "száraz kémia" kialakulása volt. Természetesen ennek a technológiának az egyik első alkalmazása volt a glükóz meghatározása a beteg vérében. Az első eszközök szignifikánsan alacsonyabbak voltak a hagyományos laboratóriumi kutatási módszereknél. Idővel azonban számos cég sikerült ilyen diagnosztikai szalagokat és fényvisszaverő fotométereket kifejleszteni, amelyek nagyon magas pontosságot mutattak az elemzésben. A One Touch glükométerek és az Life Scan (USA) tesztcsíkok széles körben népszerűek a világ minden táján, és sikeresen egyesítik a kvantitatív enzimatikus módszer analitikai pontosságát a „száraz kémia” sebességével és egyszerűségével.

Az egyérintéses vércukorszint mérők úgy vannak tervezve, hogy gyorsan és pontosan mérjék a vér vérszintjét. A One Touch tesztcsík tartalmazza a kétlépéses glükóz-oxidáz módszerhez szükséges összes kémiai komponenst, beleértve a glükóz-oxidáz és a peroxidáz enzimeket, amelyek egy egyedi porózus hidrofil membránra adszorbeálódnak. A reakció eredménye egy színes komplex kialakulása. A fejlett szín intenzitását fényvisszaverő miniphotométerrel rögzítjük.

Az One Touch membrán tesztcsík mikroszkópos pórusokkal ellátott szivacshoz hasonlít és hármas funkciót hajt végre. Ennek hatására: 1) tartályként, a szükséges mennyiségű vér összegyűjtése, 2) szűrő, blokkolja a szilárd sejtanyagot (eritrocitákat, leukocitákat stb.), 3) sima optikai felületként, amelyen a visszaverődő fény mérhető. Ez utóbbi funkció különösen fontos az eszköz működéséhez. Lehetővé teszi a szalag alsó részének olvasását, míg a vér a tesztcsík felső részén marad. Ennek megfelelően nincs szükség a vér átmosására a tesztcsík felületéről.

Emellett a membrán hidrofil tulajdonságokkal rendelkezik, aminek következtében egy csepp vér vonzódik a tesztcsík felületéhez, amikor megérinti.

Az One Touch készülék két speciális LED-et tartalmaz. A kifejlesztett szín feldolgozása a tesztcsíkon a következő. Amint a tesztcsíkot behelyezzük a készülékbe, nulla leolvasás történik. Ekkor a kijelzőn látható: „WAIT”. Amikor egy csepp vér kerül a vizsgálati csíkra, a vérplazma azonnal a membránon szaporodik, míg az eritrociták és a felesleges plazma a membrán felületén marad. Egy csepp vér teljes felszívódása után azonnal festés történik. A készülék rögzíti a reflexió nagyságának változását és automatikusan elindítja az időzítőt. 45 másodperc múlva a kémiai reakció véget ér, a fényvisszaverődés eredménye feldolgozásra kerül. A színes reakciótermék elnyeli az első LED által kibocsátott fényt. A vérsejtek és a felesleges plazma is felszívja a dióda által kibocsátott fényt. A háttér-visszaverődés korrigálásához a második olvasást egy másik LED-en végzik el egy másik hullámhosszon. Az első és a második LED-ek közötti jelek közötti különbség információt szolgáltat a fény kromogén által történő felszívódásáról. A kromogén által a glükózkoncentráció becsléséhez kapott jel egy speciális kalibrációval korrelál. Minden One Touch készüléket kalibrálunk a referencia módszerrel laboratóriumi glükóz analizátoron. Ezzel az eljárással standard kalibrációs görbét kapunk. Megjegyezzük, hogy a reagensek nagyon alacsony koncentrációja miatt meglehetősen nehéz kémiai úton azonos tesztcsíkok előállítását megkezdeni. A probléma megoldásához standard kalibrációs görbét alkalmaznak, amely 16 kalibrációs sorból áll. A minőségellenőrzést közvetlenül a tesztcsíkok gyártása után végezzük, amely lehetővé teszi, hogy meghatározzuk, hogy a kalibrációs vonalak közül melyeket (1-16) lehet alkalmazni a tesztcsíkra. Ez az úgynevezett kódszám, amely a tesztcsík csomagolásán van elhelyezve. Ezeket a 16 kalibrációs vonalat a műszer mikroprocesszorában is programozzák. Az optimális eredmény eléréséhez a tesztcsík csomagolásán feltüntetett kódszámot a készülék a kódgomb segítségével állítja be. Így a készülék helytelenül telepített kódja mérési hibát okozhat.

A One Touch készülékek piacon történő megjelenése óta számos klinikai vizsgálat telt el az orosz, amerikai és európai laboratóriumokban. Az egyik ilyen tanulmányt az orosz Orvostudományi Akadémia Endokrinológiai Tudományos Központja végezte az orosz Orvosi Laboratóriumi Diagnosztika Egyesület kérésére. A központ szakemberei összehasonlító elemzést végeztek a vércukorszint mérésére szolgáló két módszerről. Az One Touch-nal kapott eredményeket összehasonlítottuk a Spectrum II biokémiai analizátoron (Abbott Laboratories, USA) kapott adatokkal, amelyek a glükóz meghatározására szolgáló hexokináz-módszert alkalmazzák. 190 betegből 95 vérmintát vizsgáltunk. Az eredmények korrelációs együtthatója 0,98641 volt. A One Touch mérő normál és patológiás tartományának variációs együtthatója nem haladja meg a 2,5% -ot.

Az orosz Orvostudományi Akadémia Endokrinológiai Kutatóközpontjának hivatalos jelentése szerint: „Az One Touch készülékek nagy pontossággal és pontossággal rendelkeznek, valamint számos mérést végeznek. Ezek felhasználhatók a cukorbetegség sürgősségi állapotainak diagnosztizálására, beleértve a sürgősségi csapatokat is, mert ezek az eszközök nemcsak megbízhatóak, hanem gyorsan is eredményeket hoznak. "

Hexokináz módszer

A regisztrálást 340 nm hullámhosszon hajtjuk végre a NADH abszorpciójánál. Ez a módszer nagyon specifikus és nem reagál a vérszérum más összetevőivel. A hexokináz módszer a glükóz meghatározás referenciaként szolgál. Általában 50 mmol / l-re lineáris, ami lehetővé tette, hogy széles körben ajánljuk az endokrinológiai osztályokkal rendelkező klinikák számára.

A leírt glükóz-meghatározási módszerek közül a QDL-alkalmazottak maguk dönthetik el, hogy melyik meghatározási módszer és milyen eszköz közül választhat:

Az automatikus biokémiai analizátorokon végrehajtott "nedves" biokémia módszerei nagy laboratóriumi vizsgálatokat igényelnek.
A Biosen típusú glükózanalizátorok minimális erőfeszítést igényelnek a kezelőtől, mivel teljesen automatizáltak és elég produktívak (sebesség 50 és 200 minta között óránként).
A kis számú vizsgálattal rendelkező laboratóriumoknál, valamint az expressz laboratóriumoknál a Mikrolab 540 speciális biokémiai fotométere kényelmes.
A súgócsapatok számára a segítség elrejtése a tökéletes megoldás - a vércukorszint mérők, például az One Touch.

Így a QDL feladata, hogy ne csak gyors, hanem nagyon pontos glükóz meghatározást is biztosítson ma.

Vércukor, vizelet, folyadék

A vércukorszint szigorúan szabályozott.

A vér glükózkoncentrációjának szabályozását idegrendszeri hatások és hormonok végzik.

Ideges szabályozás

A vér glükózkoncentrációjának idegrendszeri szabályozását az n.vagus inzulinszekrécióra gyakorolt pozitív hatása és a szimpatikus beidegzés folyamatának gátló hatása fejezi ki. Emellett az adrenalin felszabadulása a vérbe szimpatikus hatással van.

Hormonális szabályozás

A fő hormonális szabályozó tényezők a glukagon, az adrenalin, a glükokortikoidok, a szomatotróp hormon, másrészt az inzulin. Valamennyi hormon, kivéve az inzulint, amely a májra hat, fokozza a glikémiát.

Az inzulin az egyetlen hormon a szervezetben, amelynek célja a vércukorszint csökkentése. A glükóz hatására az izmok és a zsírszövet erősen felszívódik.

Az inzulin vércukorszintjének csökkenését az alábbi módokon érjük el:

a glükóz átjutása a sejtekbe - a GluT 4 transzporter fehérjék aktiválása a citoplazmatikus membránon, t
glükóz-részvétel a glikolízisben - a glükokináz szintézisének növekedése, egy glükózcsapdának nevezett enzim, más kulcsfontosságú glikolízis enzimek szintézisének stimulálása - foszfofruktokranáz, piruvát kináz,
fokozott glikogén szintézis - a glikogén szintáz aktiválása és szintézisének stimulálása, ami megkönnyíti a glükóz feleslegének glikogénré alakulását.
a pentóz-foszfát út aktiválása - a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és a 6-foszfoglukonát-dehidrogenáz szintézisének indukálása, t
megnövekedett lipogenezis - a glükóz bevonása a triacilglicerinek vagy foszfolipidek szintézisébe.

Sok szövet teljesen inzulin az inzulin hatására, ezeket inzulin-függetlennek nevezik. Ezek közé tartozik az idegszövet, az üveges test, a lencse, a retina, a glomeruláris vesesejtek, az endoteliális sejtek, a herék és a vörösvértestek.

A Glucagon vércukorszintet emel:

a glikogén-foszforiláz aktiválásával fokozódó glikogén mozgósítása, t
glükoneogenezis stimulálása - az enzimek piruvát-karboxiláz, foszfoenol-piruvát karboxikináz, fruktóz-1,6-difoszfatáz növelése.

Az adrenalin hiperglikémiát okoz:

a glikogén mobilizáció aktiválása - a glikogén foszforiláz stimulálása, t

A glükokortikoidok növelik a vércukorszintet

azáltal, hogy elnyomja a glükóz átmenetét a sejtbe,
a glükoneogenezis stimulálása - növeli a piruvát-karboxiláz, foszfoinolpiruvát karboxi-kinaáz, fruktóz-1,6-difoszfatáz enzimek szintézisét.

A táblázat összefoglalja a hormonális hatások főbb szempontjait:

A glikogenolízis aktiválása a májban;
A glükoneogenezis stimulálása;

Megnövekedett glükoneogenezis;
Csökkentett membránáteresztő képesség a glükózhoz.

Vércukorszint a klinikai gyakorlatban

Az összes oldható kis molekulatömegű vér szénhidrát több mint 90% -a glükóz; ezenkívül fruktóz, maltóz, mannóz és pentóz is jelen lehet kis mennyiségben, és patológia esetén galaktóz. Ezekkel együtt a vérben fehérjékhez kapcsolódó poliszacharidokat tartalmaz.

Különösen intenzíven a glükózt fogyasztják és használják a központi idegrendszer, a vörösvérsejtek, a vesék vérszövetének különböző igényeihez. A közbenső metabolizmusban a glükózt glikogén, glicerin és zsírsavak, aminosavak, glükuronsav és glikoproteinek képződésére használják. A vérben a glükóz koncentrációja a trikarbonsavak glikolízisének és oxidációjának a TCA ciklusban, a májban és az izomszövetben a glikogenezis és a glikogenolízis, a máj és a vesék glükoneogenezise, valamint a bélből származó glükózbevitel.

A klinikai gyakorlatban a vércukorszintet általában vizsgálják, más cukrok koncentrációját és a glikogén mennyiségét sokkal ritkábban alkalmazzák. Emberi vérben a glükóz meglehetősen egyenletesen oszlik el a plazma és a képződött elemek között, megállapították, hogy a vénás vér cukortartalma 0,25-1,0 mmol / l (átlagosan 10%) kisebb, mint az artériás és kapilláris vérben. A tejsav- és piruvinsavak meghatározása, számos szénhidrát anyagcsere enzim, szialikus és hexuronsavak, szeromukoidok, glikozilált hemoglobin és más indikátorok aktivitása ismert diagnosztikai értékkel rendelkezik.

A vizeletben lévő glükóz-tartalom a vérben mért koncentrációjától függ, bár a normál és a magas vércukorszint között kiválasztódik. A vérben a glükózkoncentráció növekedésével az ún. Veseküszöb leküzdése (egészséges embereknél 8,3–9,9 mmol / l) és a glükózuria alakul ki. Cukorbetegségben szenvedő arterioszklerotikus vese esetén a küszöbérték emelkedik és a glükózuria nem észlelhető még a glükózkoncentráció 11,0-12,1 mmol / l-re történő emelkedésével.

A vércukorszint meghatározásának módszerei

A vércukorszint meghatározására szolgáló módszerek három csoportra oszthatók: redukció, kolorimetriás és enzimatikus.

Csökkentési módszerek (Figyelembe kell venni, hogy ennek a csoportnak a módszerei túlértékelt eredményeket adnak (kb. 20-25%), mivel a vér számos olyan vegyületet tartalmaz, amelyek nem kapcsolódnak szénhidrátokhoz, de csökkentő tulajdonságokkal rendelkeznek (húgysav, glutation, kreatinin, aszkorbikus). sav)):
- A Hagedorn-Jensen titrometriai módszerének alapja a cukor tulajdonsága, hogy lúgos közegben, vasban és szinuszban és vas-iszapált káliumsókban állítsuk vissza. A visszanyerés mértéke szerint a vércukor koncentrációját titrometriával vizsgáljuk. A módszer fontos előnye az alacsony költség és a laboratóriumi használat lehetősége;
- a nitrobenzolok redukcióján, például pikrinsavon a pikraminsavra;
- a glükóz azon képességén alapuló módszer, hogy csökkentse a rézsókat. A kapott monovalens réz közbenső termékként működik. A levegő oxigénnel oxidálva helyreállítja az arzén-molibdinsavat vagy a foszforotungstinsavat, amely a végső kromogénként szolgál.
Kolorimetriás módszerek. Ezek a következők:
- Somodji módszer - réz-orron-reagens összetételében lévő réz redukciós reakciója réz-oxidra. A módszer munkaigényes, többlépcsős, nem specifikus és jelenleg gyakorlatilag nem használatos;
- Folin-Wu módszer - réztartarát lítium-oxidra redukálása. A módszer egyszerű, a hátránya az, hogy a kapott szín intenzitása és a glükóz koncentrációja között nincs szigorú arányosság;
- a glükózkoncentráció meghatározása Morris és Roe szerint - a glükóz dehidratálása kénsav hatására és annak oximetilfurfurálissá való átalakulása, amely artronnal kondenzálódik kék vegyületké. Szükség van a legtisztább reagensekre és az állandó reakcióhőmérséklet szigorú betartására;
- Gultman-féle orthotoluidin-módszer a Khivarinen-Nikkil módosítása során, amely az oldatfestés intenzitásának meghatározásakor jelentkezik, amikor egy aromás amin ortotolidin kölcsönhatásba lép a glükóz aldehidcsoportjával savas közegben. Ez a módszer pontos és lehetővé teszi a glükóz pontosabb meghatározását.
- Az anilin-módszer megőrzi az orthotoluidin-módszer érzékenységét, de még pontosabb.
Enzim módszerek:
- a hexokináz reakció alapján. A hexokináz hatására a glükóz ATP-vel foszforilálódik, a kapott Gl-6-F dehidrogenáz jelenlétében helyreállítja a NADP-t. Az utóbbi mennyiségét az ultraibolya régió fényelnyelésének növekedése határozza meg. A módszer túl költséges a gyakorlati laboratóriumok számára.
- a glükóz oxidációján alapuló glükuronsavvá, a glükóz-oxidáz enzimmel és a hidrogén-peroxid reakciójának kialakulásával, amely (különböző változatokban):
  - kémiai eszközökkel meghatározva;
  - a peroxidáz részvételével a színtelen ortotolidin oxidálódik, zöld-kék színű vegyületté alakítva, a glükózkoncentráció színfüggőségének egyenessége 1,1 és 22 mmol / l között marad;
  - fenol jelenlétében, peroxidáz részvételével, oxidálja a 4-aminoantipirint egy színes, bíbor színű vegyületté;
  - rézionok jelenlétében fenolftalint oxidál fenolftaleinné, amely lúgos körülmények között vörös színű.
Az elektrokémiai eljárások, amelyek immobilizált enzimeket, különösen glükóz-oxidázt tartalmazó elektródokat használnak. A reakciót a képződött hidrogén-peroxid mennyisége vagy a glükóz oxidációjához szükséges oxigénveszteség rögzíti.
Diagnosztikai csíkok, amelyek kromogénként glükóz-oxidáz-peroxidáz-reakciót és benzidin-származékokat használnak.

Három módszert alkalmaztunk egységesítettként: a Haggedorn-Jensen titrometriás módszer, az orto-toluidin módszer és az o-tolidin glükóz-oxidáz módszer.

A glükóz meghatározása orthotolidin módszerrel

alapelv

A glükóz kénsav jelenlétében orthotolittal melegítve kék-zöld színű.