Inzulin termelési technológia

Elemzések

Az inzulin egyike az emberi test által termelt hormonoknak, különösen a hasnyálmirigynek. Az anyag szekréciójának megsértése olyan súlyos betegség kialakulásához vezet, mint a cukorbetegség. A kezelésére szintetikus hormon, amely hosszú ideig izolált az hasnyálmirigy. Azonban az inzulin előállításának technológiája nagyon gyakori baktérium - Escherichia coli vagy élesztőgomba - segítségével már régóta használatos. Ezzel a módszerrel elkerülhető az idegen fehérje által okozott allergiás reakciók, amelyek enyhe eltérést mutatnak az emberektől.

Technológiai rendszer

Az inzulin termelési technológiája magában foglalja a biotechnológiai termékek gyártásának valamennyi fő szakaszát. Az eredmény egy kristályos végtermék, amelyet azután az I. és II. Típusú diabetes mellitus kezelésére használt injekciós oldatok előállítására használnak. Ennek a hormonnak a fő hatása a szervezetben a vérben lévő glükózszint csökkenésében nyilvánul meg.

Az inzulintermelés szakaszai a következők:

Előzetes. Olyan műveleteket végez, mint a víz és a levegő előkészítése és tisztítása, az ipari helyiségek tisztítása és a berendezések sterilizálása, a személyzet ellenőrzése, a kézfeldolgozás és a steril cipők és ruházatok kiadása. A kezdeti szakaszban a molekula láncok elsődleges kémiai szintézise, amelyből a fehérjét összeszerelik, készül. Az A lánc 21 aminosav maradékot tartalmaz, és a B lánc 30 aminosavat tartalmaz.
Tápoldatok és sejtkultúra előállítása. Ahhoz, hogy egy élő sejtet hozzuk létre a szükséges vegyületet, a megfelelő gént vezetjük be. Ehhez a plazmidot speciális enzimekkel, korlátozásokkal vágjuk, és a szükséges vegyületek szintézisét kódoló géneket varrjuk bele. Ezután egy mikroinjekciós módszerrel a módosított plazmidot visszajuttatjuk a sejtbe.
A sejtszuszpenzió termesztése. A genetikailag módosított sejteket tápoldatba helyezzük, és minden olyan összetevővel rendelkezünk, amely szükséges a növekedéshez és a szaporodáshoz és a sterilizáláshoz. A tenyésztés speciális bioreaktorokban történik, ahol az előtisztított levegőt tápláljuk. A reaktorba rendszeresen hozzáadunk bizonyos mennyiségű tápoldatot, és ugyanakkor visszavonjuk ugyanazt a térfogatú sejtszuszpenziót.
A kultúra elosztása. A folyadék és a sejttenyészet elválasztását speciális üledékekben, üledékkel (ülepítéssel), majd szűréssel végezzük, amely lehetővé teszi a sejtek integritásának megőrzését.
Az anyag kromatográfiás tisztítása. Ezt a megfelelő berendezéssel végezzük, különböző módszerekkel, különösen frontális, anioncserélő és gélpermeációs kromatográfiával.
A fehérje molekula megszerzése. A tényleges biotechnológiai szakaszban egy nem termelt inzulin molekula szintézise következik be. És a láncok két összetevője. A kapott láncok oxidációja és összecsukása után összeragadnak, így diszulfid hidak képződnek.
Fagyasztva szárítás egy speciális kemencében, amely után a kapott kristályos készítményt ellenőrzik a szabványnak való megfelelés szempontjából, csomagolják, címkézik és szállítják a fogyasztónak.

Cégünk kedvező feltételek mellett kész gyártósorokat kínál, ahol az inzulingyártás valamennyi technológiája teljes mértékben megfelel. A pontos számításoknak, a technikai és információs támogatásnak, valamint az átfogó program keretében végzett személyi képzésnek köszönhetően a vállalat nyereséges lesz, és termékei keresletet kapnak.

Inzulin felfedezés

Napjainkban a cukorbetegség több mint 400 millió embert érinti a bolygón, ami a világ felnőtt lakosságának mintegy 8% -át érinti. Az állami nyilvántartás szerint Oroszországban több mint 3,3 millió ember szenved cukorbetegségben (körülbelül 300 ezer ember szenved 1-es típusú cukorbetegségben, és mintegy 3 millió ember szenved 2-es típusú cukorbetegségben). Ezek a számadatok azonban valószínűleg nem tükrözik a valós helyzetet. Mindezek az emberek, akik nap mint nap élnek, megértik, hogy életük az inzulintól függ.

A diabétesz gyógyítására tett első kísérleteket a korunk előtt végeztük. Ősi görög és római orvosok használják ezt a masszázst, torna, fürdők, aromaterápia és még sok más. A 19. században a cukorbetegek számára alacsony szénhidráttartalmú étrendet fejlesztettek ki. Az első inzulin injekcióval történő diabetes kezelésére tett kísérletet 1921-ben végeztük. A kanadai tudós Frederick Banting lett az első személy, aki inzulin hormonot használt a cukorbetegség kezelésére. Csak 32 kód volt, amikor megkapta a Nobel-díjat az orvostudományban. Hatékonyan létrehozta a gyógyszert, és mellékhatások nélkül 28,9-ről 6,7 mmol / l-re csökkentette a glükózszintet. Ez a kábítószer sok reményt adott az életnek.

1869-ben Paul Langergans tudós felfedezte a hasnyálmirigyben lévő sejtcsoportokat, amelyeket később "Langerhans szigetei" neveztek el. Az inzulint ezután izoláltuk ezen szigetek sejtjeiből. Az inzulin egy hormon, amely szabályozza az anyagcserét, elsősorban a szénhidrátokat (cukrokat), de a zsírokat és a fehérjéket is. A cukorbetegségben az elégtelen inzulin-expozíció miatt összetett anyagcsere-rendellenesség lép fel, a vércukorszint emelkedik (hiperglikémia), a cukor kiválasztódik a vizelettel (glikozuria), és a zsírégetéssel járó savas termékek a vér-keton testekben (ketoacidosis) jelentkeznek.

Az inzulin felfedezése után sok tudós kezdte kidolgozni a gyógyszer tisztítására szolgáló módszereket, mivel szennyeződések káros hatással vannak a gyengített testre.

Az Agilent Technologies az analitikai berendezések globális vezetője. A kromatográfiás és spektrális analízisre szolgáló eszközök több mint egy éve segítették a világ tudósait a gyógyszerkészítmények alapvető problémáinak megoldásában. Az inzulin tisztaságának ellenőrzése nem kivétel. Korábban klasszikus folyadékkromatográfiát alkalmaztak ezekre a célokra, miközben meglehetősen elfogadható eredményeket kaptak:

Sok kutatást követően a tudósok bebizonyították, hogy a képződött inzulin polipeptid körülbelül 6000-es molekulatömeggel hatékonyan azonosítható a kizárási kromatográfia területén a legújabb fejlesztésekkel.

Ezzel az új módszerrel összehasonlítható a „jó inzulin”, amelyet az ajánlott körülmények között és a „rossz inzulin” tárolt. Ha két kromatogramot helyeztek egymásra, kiderült, hogy az inzulinkészítményben, amelyet kedvezőtlen körülmények között tároltak, a célmolekula megsemmisült, és helyette a bomlástermékeket azonosítottuk a kromatogramon.

Az inzulin készítmények analízisére és szabványosítására szolgáló módszerek kifejlesztése és egységesítése fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

A disszertáció értekezésének a könyvtárhoz kell mennie a közeljövőben.
Értesítés a felvételről

Az értekezés - 480 rubel., Szállítás 10 perc, éjjel-nappal, hét nap egy hét és ünnepek.

Absztrakt - 240 rubel, szállítás 1-3 óra, 10-19 (Moszkva idő), kivéve vasárnap

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Az inzulin készítmények analízisére és szabványosítására szolgáló módszerek kifejlesztése és egységesítése fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával (RP HPLC): disszertáció. Gyógyszerészeti tudományok jelöltje: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Védelmi hely: Moszkva Orvostudományi Akadémia].- Moszkva, 2005.- 139 pp.: Il.

A disszertáció tartalma

1. FEJEZET Az irodalom áttekintése 11

1. Az inzulin szerepe a cukorbetegség kezelésében 11

2. Az inzulin bioszintézise és biológiai hatása 12

3. Az inzulin fizikai-kémiai és gyógyszerészeti tulajdonságainak általános jellemzői 15

4. Inzulin készítmények 24

5. Az inzulin készítmények gyártási módszerei, szabványosítása és minőségellenőrzése 31

6. A HPLC alkalmazása az inzulin gyógyszerészeti elemzésében. 46

2. FEJEZET. Probléma-nyilatkozat 50

3. FEJEZET Különböző tényezők hatásának vizsgálata az inzulin kromatográfiás viselkedésére az RP HPLC 56 körülmények között

1. Módszerek és anyagok 57

2. Az eredmények megvitatása 62

2.1. A pufferoldat 62 összetételének hatása

2.2. A nátrium-szulfát koncentráció hatása 68

2.3. A kromatográfiás oszlophőmérséklet hatása 70

2.4. A szerves módosító 75 hatása

2.5. Az oltott fázis 80 alkilcsoportjának hosszúságának hatása

2.6. A kromatográfiás oszlop 80 hosszának hatása

4. FEJEZET. Az inzulin készítmények analízisére szolgáló farmakopoeális módszerek javítása az RP HPLC 82 alapján

1. Az optimális körülmények kiválasztása az inzulin és a szennyeződések kromatográfiás meghatározására gyógyászati készítményekben 82

2. A módszer metrológiai jellemzői 84

3. A kifejlesztett módszertan alkalmazása a hivatalos inzulin készítmények vizsgálatára 95

5. FEJEZET Az izofán-inzulin injektálható adagolási formáinak a PF HPLC módszer alapján történő elemzésének módszerei

1. Az izofán-inzulin 110 adagolási formáiban a protamin kromatográfiás meghatározásának feltételei

2. Különböző halfajokból izolált protaminok kromatográfiás profiljának vizsgálata 121

3. Eljárás az izofán-inzulin készítményekben a protamin meghatározására 123

4. A kidolgozott módszertan érvényesítése 125

Általános következtetések 136

Hivatkozások 139

Az inzulin fizikai-kémiai és gyógyszerészeti tulajdonságainak általános jellemzői

Kémiai szempontból az inzulin egy kis gömbfehérje, amelynek molekulatömege legfeljebb 6000 Da. Ugyanakkor meg kell jegyezni, hogy az inzulin a természetes és mesterséges eredetű homológ fehérjék egy közös családja, amely közös jellegzetes biológiai aktivitással rendelkezik. Az inzulin fehérje jellege 1928-ban jött létre [52]. A fehérjék közé tartozik a biuret reakció és a Pauli reakció. Az inzulin szerkezete teljesen kialakult az 50-es évek elején. A különböző eredetű inzulinok elemi kémiai összetételét az 1. táblázatban megadott számadatok jellemzik [40].

Aminosav-összetétel. A legtöbb inzulinmolekula 51 aminosavmaradékot tartalmaz, amelyek közül 17 a legtöbb ismert fehérjében található.

A szarvasmarha-, sertés- és humán inzulin aminosav-összetételének jellemzője a triptofán és a metionin. Az ilyen típusú inzulinok aminosav-összetételét a 2. táblázat mutatja be [40,46].

Valamennyi inzulin típusra vonatkozó invariant a cisztin tartalma (6 félcisztin maradék). Emellett az összes típusú inzulin molekula 6 amidcsoportot (aszparagin, glutamin) tartalmaz.

Az inzulin felszabadulása mellett a fő frakcióval együtt megfigyelhetők az inzulin dezaminált formáinak frakciói. A savas környezetben a dezamidálás folyamatában az összes 6 amidcsoport fokozatosan elválasztható, és az inzulinváltozások elektroforetikus és kromatográfiás mobilitása [40]. Az inzulin deamidált formáinak kialakulását az ammónia meghatározásának eredményei alapján lehet megítélni. Az inzulin teljes amid formájához 6 mól ammóniát 1 mol fehérjére határoztunk meg, deamidált formák esetén ez az érték 5 és 0 között lehet.

Az inzulin elsődleges szerkezete. Az inzulin elsődleges szerkezetét a Sanger csoport 1945-1955-ben megfejtette. Számos kromatográfiás módszerrel, amely lehetővé tette a különböző peptidek, aminosavak és származékaik elkülönítését és azonosítását, a Sanger képes volt meghatározni a szarvasmarha-inzulin primer szerkezetét [130,131,132,133,134,135]. Különböző eredetű inzulinok további vizsgálata különböző fizikai-kémiai módszerekkel, beleértve a hosszú aminosavak teljes aminosav-szekvenciájának meghatározására szolgáló Edman-módszert, megerősítette Sanger és társszerzői megállapításait az inzulin szerkezetéről [bb].

Napjainkig az inzulin elsődleges szerkezetét négy állatcsoportba tartozó 24 faj képviselői határozzák meg: emlősök, madarak, halak és ciklostomák [14]. A különböző eredetű inzulin kutatása folytatódik [71,72,73].

Az inzulin szerkezete különböző állatokban hasonló, de nem azonos. Elsődleges szerkezetében a humán inzulin hasonlít a sertés, a kutya, a sperma bálna és a nyúl inzulinokhoz, amelyek csak egy aminosavban különböznek [40]. A szarvasmarha-inzulintól három aminosavtól eltér. Nagyobb mértékben a humán inzulin nem hasonlít a guineai sertés, a madarak és a hal inzulinjához [40]. A humán, sertés és szarvasmarha-inzulin aminosav-szekvenciájának különbségeit a 3. táblázat mutatja.

A strukturális különbségek ellenére az inzulinok minden típusa hasonló biológiai aktivitással rendelkezik, vagyis az inzulinokhoz hasonlóan. hipoglikémiás hatást okozhat. A megjelenített biológiai aktivitás nagysága azonban nagymértékben függ a fajtól, és 11 IU / mg (az északi-tengeri tőkehal-inzulin) és 62 NE / mg (pulyka és csirke inzulin) között van, míg a humán inzulin aktivitása körülbelül 25-30 NE. / mg [40]. Minél nagyobb a fajok közötti különbségek, annál nagyobb a különbség a megfelelő inzulin biológiai aktivitásában.

A funkcionálisan aktív inzulinmolekula két polipeptidláncból (A és B lánc) áll, amelyek diszulfidkötésekkel kapcsolódnak; az egyik kötést a két lánc hetedik aminosavmaradékai alkotják, a második diszulfidkötést az A-lánc 20. maradéka és a B-lánc 19. aminosava képezi (2. ábra). Emellett van egy harmadik diszulfidkötés az inzulin molekulában, amely intrachain, és összeköti a 6. és 11. A-láncmaradékot [59,117].

Másodlagos szerkezet Különböző fizikai-kémiai és fizikai kutatási módszerek alkalmazásával kimutatták, hogy az inzulin molekula nagymértékben rendezett térszerkezettel rendelkezik (konformáció), amely hozzájárul a specifikus biológiai funkciók megvalósításához [14]. A natív inzulin molekulájában egyidejűleg mind a cc-helix, mind a p-fold lapok jelen vannak. Ezen kívül vannak olyan területek, amelyek rendezetlen szerkezettel és szerkezettel rendelkeznek <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Ha az inzulin savas oldatát (pH 2,3-2,5) +100 ° C hőmérsékleten melegítjük és gyorsan -80 ° C-ra hűtjük, úgynevezett fibrilláris inzulin képződik - a hormon teljesen inaktív formája [27]. A fibrilláris inzulinszálak aktív inzulin oldatba történő bevitele spontán kvantitatív inzulin kicsapódást okoz fibrillumok formájában [14,17].

Az inzulin készítmények gyártási módszerei, szabványosítása és minőségellenőrzése

Állati inzulin fajok beszerzése. A marhahús és a sertés inzulin ipari termelését számos országban szinte egyidejűleg állapították meg, miután az inzulin felfedezése 1921-ben történt [63]. Azóta az inzulinszerzés fogalma gyakorlatilag változatlan maradt (b) táblázat [17, 18]. Az inzulinállatfajok előállításához szükséges nyersanyagok a vágásra szánt szarvasmarhák hasnyálmirigyei.

Az inzulin termelésének legfontosabb feladata a tisztítás - a kapcsolódó szennyeződésekből származó anyagok kibocsátása, amelyek csökkentik a biológiai aktivitást, immunológiai reakciókat okoznak, vagy potenciálisan veszélyesek a beteg egészségére. Például, néhány év után, amikor a beteg vérében rosszul tisztított inzulint alkalmaztak, az antitestekhez kötődve akár 5000 NE is lehet. Az inzulin antitestek jelentősen befolyásolják hatásának profilját, és ezáltal hozzájárulnak a cukorbetegség labilis lefolyásához.

Az első eljárás az inzulin tisztítására cink sók jelenlétében végzett átkristályosítás. 1945-ben bebizonyosodott, hogy az inzulin hétszeres átkristályosodása jelentősen csökkenti az allergiás reakciók szintjét a betegeknél, összehasonlítva az akkoriban hivatalosan alkalmazott inzulinkészítményekkel [63].

A kristályosodás és az egyszeri átkristályosítás után az inzulin minták heterogenitását számos módszerrel mutatjuk be: ellenáramú extrakció (PE), eloszlási kromatográfia (PX), ioncserélő kromatográfia (IOC), lemezelektroforézis (DEP) és gél kizárási kromatográfia (GEC) [63].

Azt tapasztaltuk, hogy a fő párhuzamos inzulin-szennyeződések a következők: proinsulin, köztitermékei, kovalens inzulin-dimere, mono-dezamido inzulin, monoarginin és mono-etilén, valamint számos nagy molekulatömegű, nem inzulin jellegű vegyület. A vizsgálatok eredményeinek általános megállapítása, figyelembe véve az észlelt szennyeződések immunológiai aktivitására vonatkozó információkat [138], az inzulin anyagok további tisztításának szükségessége volt, így DEF és GEC módszerekkel történő elemzés során egy komponenst találtunk - a megfelelő inzulint.

Az inzulin 1950-es tisztítási problémájának megoldására a HEC-módszert javasolták, 1970-ben pedig anioncserélő kromatográfiás (AOX) módszerrel. Azt találták, hogy az AOX módszerrel tisztított inzulin körülbelül 500 ppm (millió ppm) szennyeződést tartalmaz proinsulin aktivitással [137]. Az inzulin további tisztítása nagynyomású folyadékkromatográfiával fordított fázisokon (RP HPLC) csökkenti az immunogén frakciók tartalmát a kimutatásuk határáig [63].

Az inzulin kromatográfiás tisztítása területén a jelenlegi fejlemények áttekintése [96]. Az inzulint, amelyet egymás után tisztítottunk IOC és GEC alkalmazásával, monokomponens inzulinnak nevezzük [63]. A humán inzulin. A humán inzulin előállítására szolgáló módszerek keresése két körülmény miatt következett be. Egyrészt az állati inzulin előállítása esetén a nyersanyagprobléma sürgőssége, másrészről a tudomány gyors fejlődése ezen a területen valós lehetőséget teremtett az ötlet életre keltésére. 1979-ben és 1981-ben majdnem egyidejűleg két módszer született a humán inzulin előállítására - bioszintetikus és félszintetikus [102,108]. 1981-ben a Novo Nordisk cég először a világon kezdte meg az emberi félszintetikus inzulin sorozatgyártását. A vállalat által alkalmazott módszer alapja az Al enzim és kémiai helyettesítése a sertés inzulinmolekulában a Tre [61] többi részével. Ez a módszer közvetlenül függ a szükséges mennyiségű sertés inzulin megszerzésétől, ami csökkenti annak gazdasági értékét. A rekombináns DNS-technológia kifejlesztésével a humán inzulin bioszintetikus módszerrel történő megszerzésének lehetősége [10]. A géntechnológiával módosított inzulintermeléssel kapcsolatos munkák körülbelül 25 évvel ezelőtt kezdődtek. 1978-ban azt jelentették, hogy patkányproinsou-ling-et termelő E. coli törzset kaptunk. 1979-ben Genentech tanulmányai képesek klónozni E. coli-ba az aminosavszekvenciákat kódoló géneket. A pBR322 plazmid p-halo-takidáz régiójában lévő A és B inzulinláncok [10,102]. 1981-ben szintetizáltunk egy mini-C-proinsulin proinsulin-gén-analógját, amelyben a 35 tagú C-peptidet hat aminosav szegmensével helyettesítettük: arg-arg-glicer-lys-arg és annak expressziója E. coli-ban. 1982-ben az Eli Lilly cég elindította a világ első humán inzulintermelését a Genentech-ben együttműködve két láncú technológiával [102]. Jelenleg a humán inzulin különféle expressziós rendszerek segítségével történő beszerzésének lehetősége látható [3,10,101,102]. Gazdasági szempontból különösen érdekes a gén-pozitív E.coli baktériumok genetikailag módosított törzseinek alkalmazása, amelyek közül sokan túltermelőknek minősülnek [3]. Ugyanakkor jelentős előrehaladás történt a Saccharomices cerevisiae élesztősejtekkel [3,75]. A 7. táblázat felsorolja a rekombináns humán inzulin előállítására szolgáló különböző módszerek főbb közös jellemzőit, a technológiai folyamat szakaszait [3,10,63].

A hivatalos inzulinkészítmények tesztelésére kidolgozott módszertan alkalmazása

A nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) az oszlop folyadékkromatográfiájának egy változata, amelyben a mozgófázis - eluens - áthalad az oszlopot nagy sebességgel töltő szorbensen, az oszlop [11] bejáratánál jelentkező jelentős nyomás (akár 400x105 Pa) miatt.

Az összetett anyagkeverékek elemzésének módjaként a HPLC egy kicsit több mint 30 éve jelent meg. A 3–10 μm-es részecskeátmérőjű szorbensek használata a kromatográfiás szétválasztás hatékonyságának hirtelen növekedését eredményezte, összehasonlítva a kolonna folyadékkromatográfiás klasszikus változatával. Ezért a HPLC-t gyakran nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának (HPLC) nevezik. A HPLC használatának instrumentális jellemzőit részletesen ismerteti számos kézikönyv [49,50] és a vezető farmakopea vonatkozó részei [79,150]. A HPLC-ben a szorbensek széles skáláját fejlesztették ki és állítják elő. A felmérés szerzői szerint [51] - mintegy 100 cég világszerte több mint 300 típusú szorbens nevet termel. A módszer történetét, jelenlegi állapotát és kilátásait a vélemények [51] és [77.78] tárgyalják.

Különböző változataiban a HPLC-módszert széles körben alkalmazzák a gyógyszerészeti elemzésben (termelés-ellenőrzés és a gyógyszer minőségének vizsgálata). A módszer a világ minden vezető gyógyszerkönyvében szerepel. Ezt a módszert a legteljesebb mértékben az európai és amerikai gyógyszerkönyvekben írják le. A HPLC-t a gyógyszerek azonosítására, a tisztaság, a molekulatömeg frakcionált összetétel és a kvantitatív elemzés meghatározására használjuk. Az US Pharmacopoeia 28 szerk. a magáncikkek mintegy 30% -a HPLC-vel kapcsolatos. Az Európai Gyógyszerkönyv 4. kiadásában. ez a szám mintegy 40%.

Az inzulin vizsgálat első kromatográfiás módszere az alacsony nyomású gél kizáró folyadékkromatográfia (GE ZhND) volt. A HPLC elvárás szerinti elválasztás elve a különböző méretű molekulák eltérő képességén alapul, hogy behatoljanak a semleges gél pórusaiba, amelyek álló fázisként szolgálnak. Az inzulin monomer és a dimer hidrodinamikai átmérője arányos a molekulatömegükkel, és 2,69 és 5,50 nm [115].

1967-ben a GE-IHDD módszer alkalmazásával kimutatták, hogy a kristályosítással tisztított inzulin kereskedelmi készítményei olyan szennyeződéseket tartalmaznak, amelyek molekulatömege meghaladja az inzulin molekulatömegét [63]. A sertés inzulin kromatogramján három csúcsot találtunk, amelyeket szokásosan a-, b- és c-komponenseknek jelöltek. Azóta számos kromatográfiás rendszert javasoltak az inzulin készítményekben a nagy molekulatömegű szennyeződések szabályozására. A szétválasztást erősen duzzadó agaróz xerogélekkel (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Vagy dextránnal (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals) végeztük, 1-3 M ecetsav oldatot használtunk IF-ként [127]. Ezeknek a szorbenseknek a nagyfokú érzékenysége a mátrix duzzadási nyomását meghaladó nyomásoknál ezeknek az anyagoknak a HPLC üzemmódban való alkalmazására alkalmatlan.

A gél-kizáró folyadékkromatográfiát nagy nyomáson (GE HPLC) alkalmaztuk az inzulin elemzéshez 1980-ban, miután a kemény vízzel kompatibilis, nagy nyomásnak kitett szorbenseket fejlesztették ki. A [151] lépésben a szétválasztást Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) oszlopokon denaturáló körülmények között végezzük (7 M karbamid, ásványi savak és nemionos oldat kombinációja). mosószerek). A denaturáló körülmények között az inzulin-elemzés szükségessége az inzulin oldatban való aggregálódásának képességével függ össze. Az inzulin elválasztására a HPLC HPLC körülmények között a „hagyományos” eluens ecetsav alkalmazását is leírták [152]. Az ecetsav használata számos előnnyel jár - minimális hatással van az elválasztott vegyületek natív szerkezetére, rendelkezésre állása, alacsony költsége, továbbá fontos tény, hogy az ecetsav képes elnyomni az inzulin társulását.

Jelenleg a HPLC ghvd egy gyógyszerkönyvi módszer az anyagokban és a kész dózisformákban lévő nagy molekulatömegű szennyeződések ellenőrzésére. Az eljárást is használják az izofán-inzulin készítmények protamin tartalmának meghatározására.

A HPLC és fordított fázisok (RP HPLC) alkalmazása a szarvasmarha és a sertés inzulin elválasztására először megmutatta, hogy ez a módszer nagy hatékonyságú az azonos szerkezetű inzulinszerű peptidek elemzésére.

A fehérjék és a polipeptidek elválasztásának mechanizmusa az RP HPLC-ben az inzulin molekulák és a hozzájuk kapcsolódó szennyeződések különböző hidrofób tulajdonságain alapul. A mai napig több tucat eljárást írtak le a különböző eredetű inzulin és származékaik, köztük a proin-szulfin, a hasnyálmirigy polipeptidek, a dezamido-származékok, az inzulin dimer kromatográfiás elválasztására. [126] megmutatta a csirke, nyúl, juh és ló inzulin elválasztásának lehetőségét. A humán, marhahús és sertés inzulin szintén elkülönült. Lloyd és Corran közzétették a marhahús, a sertéshús, a humán inzulin és a megfelelő dezaminált formák elválasztási módját [104].

Az elválasztást szilikagél-szorbensekkel módosított, metil-, butil-, oktil-, oktadecil- és fenilcsoportokon végezzük izokratikus vagy gradiens módban. PF-ként szerves módosítókat használunk - acetonitril, metil-alkohol, izopropil-alkohol, szervetlen sókat és ionos gőz reagenseket tartalmazó vizes pufferoldatokkal összekeverve. A csúcsérzékelést főleg a spektrofotometriás módszerrel hajtjuk végre 190-220 nm hullámhosszon, fluorimetriás módszereket is leírtak [103].

Az anyag és az inzulin kész adagolási formáinak elemzése RP HPLC-vel az amerikai és az Európai Gyógyszerkönyvben [79,150] található magán cikkekben van leírva. Az eljárást a meghatározott csoport gyógyszereinek tesztelésére használják az "inzulin-hitelesség", a "kapcsolódó fehérjék", a "mennyiségi meghatározás" és az "oldat inzulin" szempontjából.

A szakirodalom az ioncserélő és affinitási kromatográfia alkalmazását írja le az inzulin elemzéshez [44,102], azonban ezeket a módszereket nem használták széles körben a gyógyszerkönyvi gyakorlatban.

Az izofán-inzulin adagolási formáiban a protamin kromatográfiás meghatározásának feltételei

A PF ionerősség növekedése általában az inzulin kapacitásarányok növekedéséhez vezet, amit számos tényező okozhat: - az ionkoncentráció növelése csökkenti a fehérje molekula töltésű csoportjainak ionizáltsági fokát, növelve annak hidrofóbosságát / - a kationok magas koncentrációja hozzájárul a szabad szilanol csoportok szűréséhez a felületen olyan fázis, amely gyengíti a fehérje protonált aminocsoportjainak nem-specifikus elektrosztatikus kölcsönhatását a mátrixgal; - a magas ionerősség befolyásolja az inzulin térszerkezetét, aminek következtében a szorbenssel való kölcsönhatásra rendelkezésre álló felület változik. A szervetlen sók koncentrációja az FS-ben befolyásolja a csúcsok alakját és az inzulin és a desamido-Asn-inzulin elválasztásának szelektivitását [143,144]. Izokratikus elúcióval LiChrosorb Сів szorbensen 0,1 M nátrium-foszfát oldattal (pH 2,3) kielégítő eredményt értek el csak akkor, ha a nátrium-szulfátot 0,1 M koncentrációban adtuk a pufferoldathoz. használjon PF-et 0,2 M nátrium-szulfát-tartalmú pufferoldatok alapján. Az ilyen magas nátrium-szulfát-tartalom negatívan befolyásolja a kromatográfiás eredmények reprodukálhatóságát az eluensek rétegzése következtében, a nagy koncentrációjú sóoldatok negatív hatást gyakorolnak a kromatográfiás berendezésekre, és így élettartamuk lerövidül. Figyelembe véve, hogy a farmakopea-analitikai módszereket több mint 20 évvel ezelőtt fejlesztették ki, érdekesnek tűnt az inzulin kromatográfiás viselkedése az OF-HPLC-vel a legújabb generáció kromatográfiás szorbensein, a nátrium-szulfát koncentrációjától függően. Ugyanakkor megpróbálták kideríteni, hogy a PF-ben lévő nátrium-szulfát-tartalom csökkenése megengedett-e a kromatográfiás rendszer szétválasztási képességének jelentős romlása nélkül. A kutatás eredményeként megállapítottuk, hogy a PF-ben a nátrium-szulfát koncentráció hatása eltér az oltott fázis típusától, valamint az inzulinfajtától függően. C4 és C beoltott csoportokkal rendelkező szorbensek a humán inzulin és a dezamido-Asn-humán inzulin csúcsainak szelektivitása nem függ a nátrium-szulfát koncentrációjától. A Diaspher-110-C18 szorbensnél a csúcsok páros szelektivitása 0,05 M-nál és minimálisan 0,1 M-nál (4. ábra). Másrészről az inzulin állatfajok és a megfelelő dezamidált AsnA21 formák elválasztásának szelektivitása nem függ az oldat ionerősségétől, ha Diaspher-110-C18 szorbensen választjuk el. C8 oltott csoportokkal rendelkező szorbens esetén a szelektivitás 1,25-ről 1,28-ra nő, a nátrium-szulfát koncentráció növekedésével (4. ábra). C4 oltott csoportokkal rendelkező szorbens esetén a marhahús inzulin esetében a szeparációs szelektivitás maximális 0,1 M nátrium-szulfáton és minimálisan 0,2 M-nál. az erők csökkentették az elválasztás szelektivitását (4. ábra). A hatékony elméleti lemezek száma növekszik a nátrium-szulfát koncentráció növekedésével. Kivételt képez a humán inzulin viselkedése a Diasfer-110-C8 szorbensen (5. ábra). Az inzulin és a dezamido-Asn-inzulin inzulin-szétválasztásának mértéke az FS ionerősségének növekedésével nő, függetlenül az inzulin fajtájától és az oltott fázis típusától (b ábra). A nátrium-szulfát-koncentráció 0,2 M-ról 0,1 M-ra történő csökkentésével a kiválasztott csúcspárok szétválasztási foka átlagosan 5% -kal csökken a humán és sertés inzulinok esetében, és 10% -kal a marha-inzulin esetében. Figyelembe véve azt a tényt, hogy az elválasztási fok abszolút értéke meghaladja a 2,0-t, véleményünk szerint az oszlop elválasztási kapacitásának mért romlása nem jelentős. Következésképpen a PF pufferoldatban a nátrium-szulfát koncentrációja a farmakopóliás analízis módszerekkel összehasonlítva 2-szer csökkenthető.

A fehérjék és peptidek elemzésére vonatkozó legtöbb vizsgálatban a szétválasztást szobahőmérsékleten végezzük. Ezenkívül néhány szerző azt jelzi, hogy a hőmérséklet szelektivitására gyakorolt hatása minimális [48]. A hőmérséklet emelkedésével azonban a helyhez kötött és a mobil fázisok közötti tömegcsere folyamata gyorsul, ami a peptidek retenciós idejének csökkenéséhez és a csúcsok szűküléséhez vezet.

Inzulin-technológia

Az inzulin szekréció megsértése. Az affiliate fotózás használata. Inzulin rendszer. A proinsulin expressziója E. coli sejtekben. Megközelítés a cukorbetegség problémájának megoldásához. A biotechnológia hozzájárulása a nem-peptid hormonok ipari termeléséhez.

Küldje el jó munkáját a tudásbázisban egyszerű. Használja az alábbi űrlapot.

A diákok, a végzős hallgatók, a fiatal tudósok, akik a tudásbázist tanulmányaikban és munkájukban használják, nagyon hálásak lesznek Önnek.

Beküldve http://www.allbest.ru/

A KAZAKSTANI KÖZTÁRSASÁG OKTATÁSI ÉS TUDOMÁNYI MINISZTÉRIÁJA

KAZAKH AGRO-TECHNIKAI EGYETEM S.SEYFULLIN-TŐL

Mikrobiológiai és biotechnológiai tanszék

A "Biotechnology mokroorganizmov" szakterületen

A témáról: inzulin technológia

Befejezett: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek?

Ellenőrzött: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

RÖVIDÍTÉSEK ÉS JELÖLÉSEK

1. A felfedezés története

2. Az inzulin megszerzése a biotechnológiában

3. A humán inzulin beszerzésének módja

4. A proinzulin expressziója E. coli sejtekben

5. Az inzulin tisztítása

6. Adagolás és adagolás

Ebben a kurzusban a következő definíciókat használták:

Protein hordozó - a hibrid fehérje szállítása a sejt vagy a táptalaj periplazmatikus térébe;

Az affinitás komponens - jelentősen megkönnyíti a hibrid fehérje kiválasztását.

A hasnyálmirigy Langerhans-szigeteinek béta-sejtjeiből képződik az inzulin (a latin. Insula - a sziget) - egy peptidhormon.

Az interleukinok a citokinek csoportja, amelyeket elsősorban leukociták szintetizálnak (ezért a „-leukin” véget választottuk).

A proinsulin az inzulin prekurzora, amelyet a hasnyálmirigy szigetelő készülékének B-sejtjei szintetizálnak.

Kromatográfia (a görög. Chroma, kromatográfia - szín, festék), a fizikai-kémiai módszer a keverékek elválasztására és elemzésére, a komponensek eloszlása alapján a két fázis között - helyhez kötött és mozgó (eluens), amely az álló helyzetben áramlik.

Kapszulázás - olyan programozási nyelv mechanizmus, amely korlátozza az objektumot alkotó összetevők (módszerek és tulajdonságok) hozzáférését, privátvá teszi őket, azaz csak egy tárgyon belül hozzáférhetővé teszi.

A fúziós fehérje (fúziós fehérje, szintén kiméra vegyület fehérje) egy olyan fehérje, amelyet két vagy több olyan gén kombinálásával kapunk, amelyek eredetileg külön fehérjéket kódoltak.

Hormonok (a görögtől. Hormao - mozgásba lépnek, indukálnak), hormonok, biológiailag aktív anyagok, amelyeket az endokrin mirigyek vagy endokrin mirigyek termelnek, és amelyeket közvetlenül a vérbe választanak ki.

A cukorbetegség endokrin betegségek egy csoportja, amely a hormon inzulin abszolút vagy relatív elégtelensége következtében alakul ki.

A szomatosztatin a Langerhans hasnyálmirigy-szigetei delta-sejtjeinek hormonja, valamint a hypothalamus egyik hormonja.

A radioimmun analízis a biológiailag aktív anyagok (hormonok, enzimek, gyógyszerek, stb.) Kvantitatív meghatározására szolgáló módszer a biológiai folyadékokban, a kívánt stabilitás versenyképes kötődése és a rokonukliddal jelzett anyagok specifikus kötő rendszerekkel.

RÖVIDÍTÉSEK ÉS JELÖLÉSEK

HPLC - nagy teljesítményű folyadékkromatográfia

cDNS - komplementer dezoxiribonukleinsav

Az inzulin fő feladata a sejtmembránok permeabilitásának biztosítása a glükóz molekulák számára. Egyszerűsített formában elmondható, hogy nemcsak szénhidrátok, hanem bármilyen tápanyag is felosztódik glükózra, amelyet más szén-tartalmú molekulák szintetizálására használnak, és ez az egyetlen tüzelőanyag a cellás erőművek számára - mitokondriumok. Inzulin nélkül a sejtmembrán permeabilitása a glükózra 20-szeresére csökken, és a sejtek éhen halnak meg, és a vérben feloldott felesleges cukor mérgezi a testet.

Az 1-es típusú cukorbetegség patogenezisének kulcsfontosságú eleme a béta-sejtek pusztulása miatt bekövetkező inzulinszekréciós károsodás - abszolút inzulinhiány. Az inzulin hatása a szövetre - relatív inzulinhiányra - fontos szerepet játszik a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásában.

Az affinitáskromatográfia alkalmazása jelentősen csökkentette az inzulinhoz képest nagyobb molekulatömegű szennyező fehérjék tartalmát a készítményben. Ilyen fehérjék közé tartoznak a proinzulin és a részlegesen hasított proinsulinok, amelyek képesek az antiinsulin antitestek termelését indukálni.

A humán inzulin alkalmazása a kezelés kezdetétől minimalizálja az allergiás reakciók előfordulását. A humán inzulin gyorsabban felszívódik, és a gyógyszer formájától függetlenül rövidebb ideig tart, mint az állati inzulin. A humán inzulinok kevésbé immunogének, mint a sertéshús, különösen a vegyes szarvasmarha- és sertés inzulinok.

A kurzus célja az inzulin technológiájának tanulmányozása. A következő célkitűzések elérése érdekében:

1. Inzulin beszerzése biotechnológiába

2. Az inzulin beszerzésének módja

H. Inzulin tisztítás

Az inzulin felfedezés története az orosz orvos I.M. Sobolev (a 19. század második fele), aki bebizonyította, hogy az emberi vérben a cukor szintjét egy speciális hasnyálmirigy hormon szabályozza.

1922-ben az állat hasnyálmirigyéből izolált inzulin először került bevezetésre egy tíz éves fiúnak, egy diabéteszes beteg meghaladta az összes elvárást, és egy évvel később az amerikai Eli Lilly cég kiadta az első állati inzulin készítményt.

Miután az elkövetkező években az első ipari inzulin-adagot megkapta, az elszigetelés és a tisztítás hatalmas módját fedte le. Ennek eredményeképpen az 1. típusú cukorbetegségben szenvedő betegek számára elérhetővé vált a hormon.

1935-ben a dán kutató Hagedorn optimalizálta az inzulin hatását a szervezetben, hosszan tartó gyógyszert javasolva.

Az első inzulinkristályokat 1952-ben szerezték be, és 1954-ben az angol biokémikus G. Senger megfejtette az inzulin szerkezetét. Az egyéb hormonális anyagokból és inzulin degradációból származó hormonok tisztítására szolgáló módszerek kifejlesztése lehetővé tette az egykomponensű inzulin nevű homogén inzulin előállítását.

A 70-es évek elején. A szovjet tudósok A. Yudaev és S. Shvachkin javasolta az inzulin kémiai szintézisét, azonban ennek a szintézisnek az ipari méretekben történő megvalósítása drága és veszteséges volt.

A jövőben fokozatosan javult az inzulinok tisztítási foka, ami csökkentette az inzulinallergiák, a veseműködés károsodása, a látáskárosodás és az immun-inzulinrezisztencia által okozott problémákat. A leghatékonyabb hormon a diabetes mellitus helyettesítő kezelésére volt szükség - homológ inzulin, azaz a humán inzulin.

A 80-as években a molekuláris biológia előrehaladása lehetővé tette mindkét humán inzulinlánc szintézisét E. coli-val, amelyeket ezután egy biológiailag aktív hormonmolekulává egyesítettek, és az orosz Tudományos Akadémia Bioorganikus Kémiai Intézeténél rekombináns inzulint kaptunk E.coli genetikailag módosított törzsekkel.

2. Az inzulin megszerzése a biotechnológiában

Az inzulin, a Langerhans hasnyálmirigy-szigeteinek peptidhormonja, a diabetes mellitus fő kezelése. Ezt a betegséget az inzulin hiánya okozza, és ez a vércukorszint emelkedésével jár. A közelmúltig az inzulint egy bika és egy sertés hasnyálmirigyéből nyerték. A gyógyszer különbözött a humán inzulin 1-3 aminosav-szubsztitúciójától, így az allergiás reakciók fenyegetése volt, különösen gyermekeknél. Az inzulin nagymértékű terápiás felhasználását a magas költség és korlátozott erőforrások korlátozzák. Kémiai módosítással az állatokból származó inzulint megkülönböztethetetlenné tette az embertől, de ez a termék költségének további növekedését jelentette [1].

1982 óta az Eli Lilly az E. colie és B-láncok külön szintézisén alapuló genetikailag módosított inzulint termel. A termék ára jelentősen csökkent, a termelt inzulin azonos az emberrel. 1980 óta a sajtóban a proinzulin gén, a hormon elő prekurzora, klónozásáról számoltak be, amely korlátozott proteolízissel halad át egy érett formába.

A kapszulázás technológiája a cukorbetegség kezeléséhez is kötődik: a kapszulában lévő hasnyálmirigy sejtek, amelyeket egyszer bevittek a beteg testébe, egy éven belül inzulint termelnek.

Az integrált genetika elindította a follikulus-stimuláló és a luteinizáló hormonok előállítását. Ezek a peptidek két alegységből állnak. A napirenden az idegrendszer oligopeptid hormonjainak, az 5 aminosavból és az endorfinokból, a morfin analógokból épült olefopeptid hormonok ipari szintézisének kérdése áll. Ezen peptidek ésszerű felhasználásával enyhíti a fájdalmat, jó hangulatot teremt, növeli a hatékonyságot, összpontosít a figyelemre, javítja a memóriát, rendbe veszi az alvást és az éberséget. A géntechnológiai módszerek sikeres alkalmazásának egyik példája a β-endorfin szintézise a fentiekben ismertetett, egy másik peptidhormon, a szomatosztatin [2] által leírt hibrid fehérje technológiával.

3. A humán inzulin beszerzésének módja

Történelmileg az első módja az inzulin terápiás célból történő beszerzésének az, hogy ennek a hormonnak az analógjait természetes forrásokból (hasnyálmirigy-szigetek, szarvasmarha és sertés) izoláljuk. A múlt század 20-as éveiben azt találták, hogy a szarvasmarha- és sertés inzulinok (amelyek a legközelebb állnak a humán inzulinhoz szerkezetben és aminosav-szekvenciában) az emberi szervezetben aktivitást mutatnak, ami hasonlít a humán inzulinhoz. Ezután a szarvasmarha- vagy sertés inzulint hosszú ideig használták az 1. típusú diabéteszben szenvedő betegek kezelésére. Néhány idő elteltével azonban bebizonyosodott, hogy bizonyos esetekben a szarvasmarha- és sertés inzulinok elleni antitestek felhalmozódnak az emberi szervezetben, ezáltal megszüntetve hatásukat.

Másrészt, az inzulinszerzés egyik előnye a nyersanyagok rendelkezésre állása (szarvasmarha és sertés inzulin könnyen beszerezhető nagy mennyiségben), amely meghatározó szerepet játszott a humán inzulin előállítására szolgáló első módszer kidolgozásában. Ezt a módszert félszintetikusnak nevezik [3].

A humán inzulin előállítására szolgáló eljárásban nyersanyagként sertés inzulint alkalmaztunk. A tisztított sertés inzulint hasították a B-lánc C-terminális oktapeptidje, majd a humán inzulin C-terminális oktapeptidjét szintetizálták. Ezután kémiailag kötődött, a védőcsoportokat eltávolítottuk és a kapott inzulint tisztítottuk. Az inzulin előállításának ezen módszerének vizsgálatakor a kapott hormon teljes azonosságát humán inzulinra mutatjuk be. Ennek a módszernek a fő hátránya a kapott inzulin magas költsége (még akkor is, ha az oktapeptid kémiai szintézise drága, különösen ipari méretekben).

Jelenleg a humán inzulint kétféleképpen állítják elő: a sertés inzulin szintetikus enzim módszerrel történő módosításával és géntechnológiai módszerrel.

Az első esetben az eljárás azon a tényen alapul, hogy a sertés inzulin különbözik a humán inzulintól az Ala30Thr B-lánc C-terminálisán lévő egyetlen szubsztitúcióval. Az alanin és a treonin cseréjét az alanin enzim által katalizált hasításával hajtjuk végre, és a karboxil-védett treonin-maradékot a reakcióelegyben nagy feleslegben rögzítjük. A védő O-terc-butilcsoport hasítása után humán inzulint kapunk. (1. kép)

1. ábra - A humán inzulin előállításának módszerei

Az inzulin volt az első fehérje, amelyet rekombináns DNS-technológiával kereskedelmi célokra kaptak. A genetikailag módosított humán inzulin előállításának két fő megközelítése van. Az első esetben a különálló (különböző termelői törzsek) mindkét láncot követi, majd a molekula összecsukása (diszulfidhidak képződése) és a misoform elválasztása. A második lépésben prekurzor (proinsulin) előállítása, amelyet enzimatikus hasítás követ tripszinnel és karboxipeptidázzal. A hormon aktív formájába. Jelenleg a legelőnyösebb az inzulin előanyagként való előállítása, amely biztosítja a diszulfidhidak helyes lezárását (a láncok külön gyártása esetén a denaturáció egymást követő ciklusai, a misoform és a renaturáció elkülönítése [3]).

Mindkét megközelítésben egyaránt lehetséges a kiindulási komponensek (A és B láncok vagy proinsulin), valamint hibrid fehérjék részeként történő előállítása. Az A- és B-láncokon vagy proinsulinokon kívül hibrid fehérjék összetételében is jelen lehet:

1) hordozófehérje - biztosítja a hibrid fehérje szállítását a sejt vagy a táptalaj periplazmatikus térébe;

2) affinitás komponens - jelentősen megkönnyíti a hibrid fehérje kiválasztását.

Ugyanakkor mindkét komponens egyidejűleg jelen lehet a hibrid fehérje összetételében. Emellett hibridfehérjék létrehozásakor a többdimenziós elv (azaz a célpolypeptid több példánya van jelen a hibrid fehérjében), ami lehetővé teszi a céltermék hozamának jelentős növelését [4].

A JM 109 N1864 törzset egy hibrid fehérjét expresszáló plazmidba ágyazott nukleotidszekvenciával használtuk, amely lineáris proinsulinból és egy metafin-maradékon keresztül N-terminálisához kapcsolt Astaphylococcusaureus fehérje fragmensből áll. A rekombináns törzs sejtjeinek telített biomassza termesztése biztosítja a hibrid fehérje előállításának megkezdését, amelynek izolálása és szekvenciális átalakítása az intub segítségével inzulinhoz vezet. A kutatók egy másik csoportja a bakteriális expressziós rendszerben egy fúziós rekombináns fehérjét tartalmaz, amely humán proinsulinból és egy polihisztidin farokból áll, amelyhez egy metionin-maradék kapcsolódik. Ezt izoláltuk kelát-kromatográfiával, inkluzív testekből származó Ni-agaróz oszlopokon, és cianogén-bromiddal emésztettük. A szerzők megállapították, hogy az izolált fehérje S-szulfurált. A kapott proinzulin térképezési és tömegspektrometriás analízisét ioncserélő kromatográfiával, anioncserélőn és RP (fordított fázisú) HPLC-vel (nagy teljesítményű folyadékkromatográfiásan) tisztítottuk, és a natív humán proinzulin diszulfid hidaknak megfelelő diszulfidhidak jelenlétét mutatott. Ugyancsak beszámolt egy új, továbbfejlesztett módszer kifejlesztéséről humán inzulin előállítására géntechnológiai módszerekkel prokarióta sejtekben. A szerzők megállapították, hogy a szerkezetében és biológiai aktivitásában kapott inzulin megegyezik a hasnyálmirigyből izolált hormonmal [5].

Nemrégiben nagy figyelmet szenteltek a rekombináns inzulin géntechnikai módszerekkel történő előállításának egyszerűsítésére. Ily módon egy, a proinsulin N-terminálisához kapcsolt interleukin-vezető peptidből álló fúziós fehérjét kaptunk lizin-maradékon keresztül. A fehérjét hatékonyan expresszáltuk és lokalizáltuk inkluzív testekben. Az izolálás után a fehérjét tripszinnel hasítottuk, hogy inzulint és C-peptidet kapjunk. A kutatók egy másik csoportja hasonló módon cselekedett. A proinsulinból és a Staphylococcus protein A két szintetikus doménjéből álló fúziós fehérjét, amely kötődik az IgG-hez, lokalizáltuk a befogadó testekben, de magasabb szintű expressziójuk volt. A fehérjét affinitás kromatográfiával izoláltuk IgG alkalmazásával és tripszinnel és karboxipeptidázzal B kezeltük. A kapott inzulint és C-peptidet RP-HPLC-vel tisztítottuk. A fúziós struktúrák létrehozásakor a hordozófehérje tömegaránya a célpolipeptidhez nagyon jelentős. Így ismertetjük a fúziós konstrukciók kialakítását, ahol hordozó polipeptidként humán szérumalbumint kötő fehérjét alkalmaztunk. Egy, három és hét C-peptidet csatoltunk hozzá. A C-peptideket fej-farok alapon egyesítettük az aminosav távtartókkal, amelyek az Sfi I restrikciós helyet és két arginin-maradékot tartalmazták a távtartó elején és végén a fehérje tripszinnel történő további hasítására. A HPLC hasítási termékek azt mutatták, hogy a C-peptid kvantitatív módon hasítható, és ez lehetővé teszi a multimer szintetikus gének módszerének alkalmazását célzott polipeptidek előállítására ipari méretben.

Mutáns proinsulin beszerzése, amely az Arg32Tyr helyettesítését tartalmazza. A protein közös hasításával tripszinnel és karboxipeptidáz B-vel natív inzulin és tirozin maradékot tartalmazó C-peptid képződött. Az utóbbit 125I jelölés után aktívan alkalmazzák a radioimmunassay [6].

Inzulinminőség-ellenőrzés

A tartalom

1. Általános információk az inzulin beszerzéséről 5

2. Az inzulin minőségének szabályozására használt módszerek 8

Hivatkozások 17

Kivonat a munkából

Az európai lakosság 1-2% -a szenved cukorbetegségben, és e betegek mintegy 20% -a nem létezhet inzulin injekció nélkül. Az 1922-es cukorbetegség kezelésére szolgáló első inzulin-kísérletek óta ez a hormon izolált az állatok hasnyálmirigyéből (tehenek és sertések). Az állati inzulin kissé eltér a humán inzulin aminosav-szekvenciájától.

Az emberi és a sertés inzulinok különösen szorosak: sertés inzulinban a B-lánc C-terminális treoninja alaninnal helyettesíthető. A tehén és a humán inzulin három aminosavban különbözik. Ezek a különbségek határozzák meg a szarvasmarha-inzulin fokozott immunogén aktivitását a sertés inzulinhoz képest.

Szinte minden olyan beteg, akit tehén inzulinnal kezeltek, a vérben az inzulin elleni antitestekkel rendelkeztek. Az inzulin antigén tulajdonságait a készítményekben lévő szennyeződések is részben meghatározzák. A legvalószínűbb, hogy az inzulin elleni antitestek kialakulása néhány kisebb mellékhatást magyarázott, amikor a tehén inzulint injektáltuk, például a bőr alatti zsír atrófiáját az ismételt injekció helyén. A nagy tisztaságú inzulin esetében ezek a hatások hiányoztak.

Ezt követően a géntechnológia és az E. Coli alkalmazásával humán inzulint kaptunk.

Az E. coli által nyert humán inzulin volt az első "genetikailag módosított" fehérje, amelyet emberekben teszteltek. Egészséges önkéntesekkel végzett kísérletek során azt találták, hogy biztonságos (nem okoz allergiás és egyéb nemkívánatos reakciókat), és képes a vérben a glükóz szintjének csökkentésére a bőr alatt vagy intravénásan beadva.

Jelenleg az ilyen humán inzulint világszerte sok cukorbeteg szerzi be. Ezt megelőzően klinikai vizsgálatok folytak, amelyek során metabolikus változásokat és immunológiai hatásokat vizsgáltak.

Témánk fontossága, hogy az ellenőrizetlen vagy rosszul ellenőrzött termelés szennyezett inzulin készítmények kibocsátásához vezethet, ami viszont káros klinikai következményekhez vezethet.

A munka célja az inzulin minőségellenőrzésében alkalmazott módszerek vizsgálata.

Irodalom

GOST R 52249-2004 "A gyógyszerek előállításának és minőségellenőrzésének szabályai" 2004

OFS 42-0002-00 „Bakteriális endotoxinok” 2000

OFS 42-0126-09 "Inzulin biológiai vizsgálata"

Az Orosz Föderáció farmakopóiás cikke FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. A humán inzulin géntechnológiája: sikerek és kilátások // Orosz vegyi folyóirat. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - 34-45.

Goncharenko G.G. A biotechnológia alapjai: Tanítási módszer. komplex a stud.biolog számára. spec. / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min. arr. RB. - Gomel: EI „GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 p.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. A kinetikus-kromogén módszer alkalmazása a bakteriális endotoxin (LAL-teszt) meghatározására a géntechnológiával módosított humán inzulin tisztítási technológiájában // Biofarmakológiai folyóirat - 2009. - 1. kötet. - №1. - 34-37. o.